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pep-1介导的重组肝细胞核因子4α蛋白转导对肝癌细胞的抑制作用

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第二军医大学学报 2015年第9期36卷 929-935页

作者：邓龙飞丁晨虹谢渭芬张新华东理工大学生物工程学院上海200237 第二军医大学长征医院消化内科上海200003

目的利用细胞穿膜肽pep-1介导重组肝细胞核因子4α(HNF4α)蛋白进入肝癌细胞,并明确外源融合蛋白PHNF4α对肝癌细胞的作用。方法构建表达质粒pET28a-P-HNF4α,优化原核表达体系的诱导条件,经大量表达、亲和层析纯化及浓缩、透析后获得... 详细信息

目的利用细胞穿膜肽pep-1介导重组肝细胞核因子4α(HNF4α)蛋白进入肝癌细胞,并明确外源融合蛋白PHNF4α对肝癌细胞的作用。方法构建表达质粒pET28a-P-HNF4α,优化原核表达体系的诱导条件,经大量表达、亲和层析纯化及浓缩、透析后获得纯度较高的带有细胞穿膜肽pep-1的融合蛋白P-HNF4α;P-HNF4α转导人肝癌细胞,蛋白质印迹法检测其穿膜效率,核质分离和细胞免疫荧光检测P-HNF4α的亚细胞定位,Real-time PCR检测肝癌细胞基因表达,CCK-8法检测肝癌细胞增殖,细胞划痕实验及小室侵袭实验检测P-HNF4α对肝癌细胞转移能力的影响。结果细胞穿膜肽pep-1成功介导融合蛋白P-HNF4α进入Huh7细胞并定位于细胞核;P-HNF4α蛋白可促进Huh7细胞肝功能基因表达,抑制干细胞相关基因表达(P1),并显著抑制肝癌细胞增殖(P1)和侵袭(P<0.05)能力。结论 P-HNF4α可诱导肝癌细胞向成熟肝细胞分化,降低肝癌细胞的恶性程度,是诱导分化治疗肝癌的潜在手段。

关键词：肝细胞癌肝细胞核因子4α 细胞穿膜肽 pep-1

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细胞穿透肽pep-1在蛋白转导中的应用

药物生物技术 2007年第2期14卷 146-148页

作者：董晓王家宁郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所湖北十堰442000

文章对细胞穿透肽pep-1在大分子物质体内外跨膜转导中的应用进行了综述,为进一步研究pep-1介导有潜在治疗价值的大分子物质跨膜转导进行疾病的蛋白治疗提供了依据。

关键词：细胞穿透肽蛋白转导域 pep-1 蛋白转导蛋白治疗

细胞穿透肽pep-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导

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基础医学与临床 2007年第7期27卷 798-801页

作者：董晓王家宁唐俊明潘国栋黄永章杨建业曹书芬郧阳医学院人民医院临床医学研究所湖北十堰442000 郧阳医学院人民医院病理科湖北十堰442000

目的研究细胞穿透肽pep-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力。方法用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和pep-1-EGFP融合蛋白,分别将500μg的EGFP蛋白和pep-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻... 详细信息

目的研究细胞穿透肽pep-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力。方法用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和pep-1-EGFP融合蛋白,分别将500μg的EGFP蛋白和pep-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻醉小鼠,PBS充分灌流并取心、脑、肝、脾、肾快速冷冻切片后立即置荧光显微镜下观察。结果2 h后pep-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠大脑、心肌、肝、脾和肾组织里出现均一的明亮绿色荧光,而EGFP蛋白处理的小鼠各脏器内均未见到绿色荧光。结论细胞穿透肽pep-1能携带增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠细胞膜并分布于心、脑、肝、脾、肾组织内,为将来用pep-1介导各种大分子药物跨膜转导进行各种疾病的蛋白治疗提供实验依据。

关键词：细胞穿透肽蛋白转导域蛋白转导 pep-1 增强型绿色荧光蛋白

pep-1-SOD1预处理对脑梗死小鼠顶叶皮质的保护作用

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中华神经医学杂志 2010年第9期9卷 897-900页

作者：董敏席刚明吴文春曹雅军李红云湖北省襄樊市中医院麻醉科 441000 郧阳医学院附属人民医院神经内科十堰442000

目的探讨pep-1-铜,锌超氧化物歧化酶（pep-1-SOD1）预处理对小鼠顶叶皮质神经元的保护作用.方法将健康成年昆明小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、pep-1-SOD1组,每组各15只.后两组建立永久性大脑中动脉闭塞模型.造模前30min假... 详细信息

目的探讨pep-1-铜,锌超氧化物歧化酶（pep-1-SOD1）预处理对小鼠顶叶皮质神经元的保护作用.方法将健康成年昆明小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、pep-1-SOD1组,每组各15只.后两组建立永久性大脑中动脉闭塞模型.造模前30min假手术组及模型组腹腔注射生理盐水200 μL,pep-1-SOD1组注射pep-1-SOD1 200 μg.24 h后取各组小鼠顶叶皮质,TTC染色测定梗死灶体积,TUNEL染色测定细胞凋亡,黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性,TBA法测定丙二醛（MDA）含量.结果与模型组相比,pep-1-SOD1组梗死灶体积明显缩小,凋亡细胞明显减少,SOD1活性明显升高,MDA含量明显下降,比较差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 pep-1-SOD1预处理可有效减轻脑梗死后顶叶皮质缺血损伤.

关键词： pep-1 铜,锌超氧化物歧化酶脑梗死

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

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药物生物技术 2005年第5期12卷 285-290页

作者：王立林严世荣汪炳华王家宁黄永章武汉大学医学院湖北武汉430000 郧阳医学院附属人民医院湖北十堰442000

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)pep-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合... 详细信息

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)pep-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建pep-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。pep-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。

关键词：细胞穿膜肽 pep-1 pep-1-p27mt融合蛋白 pET15b-pep-1-p27mt 重组表达子抑癌基因

细胞穿膜肽pep-1与vMIP-Ⅱ的融合表达与纯化

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基因组学与应用生物学 2010年第6期29卷 1026-1032页

作者：罗燕谭晓华狄春红程建兵陈佳红杨磊石河子大学新疆地方病与民族高发病省部共建教育部重点实验室新疆石河子大学生命科学学院石河子832002 杭州师范大学医药卫生管理学院杭州310036

细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽,其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。本研究构建了含有细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合表达质粒pET15b-pep-1-vMIP-... 详细信息

细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽,其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。本研究构建了含有细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合表达质粒pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定出可溶性的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ。通过对IPTG浓度、温度等诱导表达条件进行优化,确定在IPTG浓度为0.2mmol/L、28℃下诱导7h可溶性蛋白的表达量相对较高,经Ni-NTA亲和层析,超滤除盐纯化获得高纯度的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,将该蛋白作用于Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察结果显示该融合蛋白能够携带目的基因穿透细胞膜。本文结果将为进一步研究vMIP-Ⅱ的功能和细胞穿膜肽技术的应用奠定基础。

关键词： vMIP-Ⅱ pep-1 细胞穿膜肽原核表达

Ii-Key和pep-1携带异种病毒表位嵌合疫苗的构建及其体液免疫效应

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Ii-Key和PEP-1携带异种病毒表位嵌合疫苗的构建及其体液免疫效应

作者：徐姗姗安徽农业大学

学位级别：硕士

跨膜糖蛋白恒定链(invariant china, Ii)在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体(MHC)II类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团(Ii-Key)在此过程中发挥重要作用。近些年,Ii-Key已被证实能够携带单一抗原或抗原肽,有效增强... 详细信息

跨膜糖蛋白恒定链(invariant china, Ii)在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体(MHC)II类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团(Ii-Key)在此过程中发挥重要作用。近些年,Ii-Key已被证实能够携带单一抗原或抗原肽,有效增强细胞免疫和体液免疫。pep-1是一种人工设计的细胞膜穿透肽(Cell penetrating peptide,CPP),具有克服细胞膜的屏障作用跨膜转导能力,以非能量、非受体依赖性的方式把蛋白质、肽段、寡核苷酸等跨膜转导入各种细胞的胞浆和胞核内。本文基于Ii-Key和pep-1载体上构建异源多表位串联肽新型疫苗,为双重防控鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)和新城疫(Newcastle disease, ND)提供参考。首先,本文构建了Ii-Key与鸡传染性法氏囊病病毒VP2肽表位(aa197-209)和新城疫病毒HN肽表位(aa345-353)的嵌合体,并将嵌合体基因插入pET-32a原核表达载体,转化E.coli Rosetta通过IPTG诱导表达,用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,免疫SPF级BALb/c小鼠,分别通过间接酶联免疫吸附试验和免疫印记试验检测小鼠体内的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明,与VP2/HN串联表位对照组相比较,Ii-Key/VP2/HN嵌合体疫苗处理组抗体效价平均提高了13.7倍。其次,将pep-1和pep-1-Ii-Key串联载体分别与VP2/HN表位连接构建嵌合体(pep-1/VP2/HN和pep-1-Ii-Key/VP2/HN),通过原核表达,融合蛋白的纯化,小鼠免疫和间接-ELISA检测抗体效价等方法,研究pep-1和pep-1-Ii-Key联合载体对VP2/HN串联肽免疫效应的影响。结果表明,与单纯VP2/HN串联肽组相比,均能有效刺激机体产生抗体(8.6和6.7倍,ppep-1-Ii-Key联合载体免疫增强效应明显低于Ii-Key载体组(ppep-1对Ii-Key免疫增强效应发挥负向调控作用。为了探究Ii-Key和pep-1免疫增效作用是否与MHCⅡ类分子相互作用的加强有关,本文在构建的原核重组质粒基础上,构建了真核表达载体pmCherry-C 1与VP2/HN、Ii-Key/VP2/HN、pep-1/VP2/HN、pep-1/Ii-Key/VP2/HN真核重组质粒,与实验室保存的pEGFP-N1-MHCⅡα真核重组质粒转化大肠杆菌DH5a,使用无内毒质粒抽提试剂盒抽提后取适量重组质粒通过脂质体LipofectamineTM2000转染293T细胞,转染24h后使用激光共聚焦显微镜下观察定位情况。结果表明,各处理组均能在胞内与MHCⅡ类分子发生共定位,但是各组间差异不明显。表明Ii-Key和pep-1免疫增效作用与其是否增加了VP2/HN表位肽与MHCⅡ的相互作用没有明显关联。综上所述,本文成功构建了VP2/HN与Ii-Key或pep-1嵌合体,发现单个载体均能有效增强异种病毒串联抗原表位的体液免疫应答水平,但是pep-1与Ii-Key联合使用时,则降低了Ii-Key免疫增效作用,相关机制有待于进一步研究。此研究结果为构建基于恒定链关键基团Ii-Key的新型疫苗提供参考。

关键词： Ii-Key pep-1 异种病毒抗原表位疫苗免疫效应

pep-1介导的HNF4α重组蛋白转导对肝癌细胞的作用

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PEP-1介导的HNF4α重组蛋白转导对肝癌细胞的作用

作者：邓龙飞华东理工大学

学位级别：硕士

肝细胞核因子4a (HNF4a)是核受体超家族成员之一,在肝细胞的分化和功能维持中起着重要的作用。细胞穿膜肽(Cell Penetrating peptides, CPPs)是一类由少于30个氨基酸组成的多肽,可以有效地将目标分子包括蛋白、RNA、DNA等导入细胞。本... 详细信息

肝细胞核因子4a (HNF4a)是核受体超家族成员之一,在肝细胞的分化和功能维持中起着重要的作用。细胞穿膜肽(Cell Penetrating peptides, CPPs)是一类由少于30个氨基酸组成的多肽,可以有效地将目标分子包括蛋白、RNA、DNA等导入细胞。本课题利用细胞穿膜肽pep-1介导重组肝细胞核因子4a (HNF4a)蛋白进入肝癌细胞,并明确外源融合蛋白P-HNF4a对肝癌细胞的作用。我们构建了能够表达P-HNF4a的表达质粒pET28a-P-HNF4a,并优化了P-HNF4a的表达与纯化条件,经浓缩、透析后获得浓度为2.1μM、纯度为81%的融合蛋白P-HNF4a;成功将P-HNF4a转导进入肝癌细胞,利用Western blot检测其穿膜效率,发现穿膜效率高达69.5%,显示pep-1可高效地携带HNF4a进入细胞;核浆分离和细胞免疫荧光检测表明P-HNF4a进入细胞后定位在细胞核,荧光素酶报告基因实验发现P-HNF4a可促进下游基因的表达,提示P-HNF4a具有转录因子的功能;P-HNF4a可促进Huh7细胞肝功能基因的表达,并抑制干细胞相关基因的表达;利用CCK-8法检测肝癌细胞的增殖,细胞划痕实验、小室迁移实验以及小室侵袭实验检测肝癌细胞转移能力,结果显示P-HNF4a显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。以上结果提示P-HNF4a可诱导肝癌细胞向成熟肝细胞分化,抑制肝癌细胞的恶性生物学行为,表明利用P-HNF4a转导肝癌细胞是诱导分化治疗肝癌的潜在手段。

关键词：肝细胞癌 HNF4α 穿膜肽 pep-1

细胞穿膜肽pep-1和人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组表达

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细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组表达

作者：马德云天津科技大学

学位级别：硕士

表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是一种含有53个氨基酸多肽单链小分子,分子量约为6.2kD。EGF对各种细胞增殖和表皮组织生长有很强的促进作用,在医学上已用于烧伤烫伤各类创伤、溃疡和角膜损伤等很多方面的治疗。此外,EGF还... 详细信息

表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是一种含有53个氨基酸多肽单链小分子,分子量约为6.2kD。EGF对各种细胞增殖和表皮组织生长有很强的促进作用,在医学上已用于烧伤烫伤各类创伤、溃疡和角膜损伤等很多方面的治疗。此外,EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢,作为化妆品添加剂添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用,因此不论是作为医疗药品还是化妆品添加剂EGF都具有巨大的潜在应用价值和广阔的市场前景。然而研究表明,EGF的透皮率很低,以0.5μg·g-1的剂量涂抹12h后累积透皮率也仅有0.993%,这说明绝大部分的EGF未能透过皮肤,其透皮吸收效果十分微弱。本课题首先利用PCR技术从人乳腺癌细胞MDA-MB-231的cDNA扩增获得了EGF基因,然后通过重叠PCR技术将EGF基因和细胞穿膜肽pep-1的DNA片段拼接在一起,分别插入到载体pGEX-6P-3中,构建了携带GST标签的EGF及EGF-pep-1 (P-EGF)融合表达质粒,并转入大肠杆菌中进行诱导表达;经优化确定最适合表达这两种蛋白的大肠杆菌菌株为BL21-TrixB (DE3)。确定重组蛋白可溶性表达量的最优发酵培养基及发酵条件为：rhEGF蛋白的最适培养基为LB基础培养基,发酵条件为：温度20℃、转速200 rpm、诱导剂IPTG浓度0.4 mmol/1、时间10 h;P-EGF的最适培养基为含1%葡萄糖的M9培养基,发酵条件为：温度20℃、转速200 rpm、诱导剂浓度0.2 mmol/1、时间8 h。表达后的蛋白先利用亲和层析技术进行分离纯化,然后用TEV酶4℃过夜消化切除GST融合标签,最后用离子交换色谱技术纯化获得目的蛋白,并经Western blot验证后,分别利用MTT法和细胞划痕实验检测蛋白的生物活性,结果显示重组蛋白rhEGF和P-EGF均能促进COS-7成纤维细胞的增殖和迁移。免疫荧光分析也证实pep-1的融合表达能够显著提高EGF穿过细胞膜的能力。本研究成功构建了EGF独立及与穿膜肽pep-1融合表达的重组大肠杆菌表达系统,为EGF更好的应用于临床及化妆品提供了新的理论指导,并为其开发生产奠定了一定的基础。

关键词：表皮生长因子化妆品添加剂细胞穿膜肽 pep-1 大肠杆菌可溶性表达