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黑龙江畜牧兽医 2018年第8期 71-74页

作者：徐国梁海英曾智勇汤德元王彬黄涛代振江叶百川张爱琼咸文何小莉贵州大学动物科学学院

为研究从猪血清中分离的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,pcv-2）与从发病猪组织中分离的pcv-2之间的差异、了解贵州地区pcv-2遗传变异情况、丰富贵州pcv-2全基因组序列库,试验采用来自贵州省毕节市金沙县、遵义市绥阳县、毕... 详细信息

为研究从猪血清中分离的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,pcv-2）与从发病猪组织中分离的pcv-2之间的差异、了解贵州地区pcv-2遗传变异情况、丰富贵州pcv-2全基因组序列库,试验采用来自贵州省毕节市金沙县、遵义市绥阳县、毕节市黔西县和贵阳市修文县的pcv-2抗体阳性猪血清,通过PCR扩增及通过T克隆获得了4株pcv-2全基因,分别命名为GZ-JS2015、GZSY2016、GZ-QX2014和GZ-XW2014,并进行测序;将测序结果与笔者收集的38株pcv-2的核苷酸序列进行比对分析。结果表明：在病毒血症期间猪血清中分离的pcv-2与从发病猪组织中分离的pcv-2并无太大差异;笔者收集的血清中贵州省为10株,其中8株为pcv-2b型、2株为pcv-2a型,说明在贵州地区流行的主要是pcv-2b型;来自贵州省同一地区的2株pcv-2处于不同的进化树分支上,与省外的pcv-2分离株亲缘关系较近,提示在贵州省流行的部分pcv-2可能由引种时流入。

关键词：猪血清组织 pcv-2 全基因组序列

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PPV、PRV和pcv-2三重PCR与pcv-2 LAMP检测方法的建立及初步应用

PPV、PRV和PCV-2三重PCR与PCV-2 LAMP检测方法的建立及初步应用

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作者：申世川南京农业大学

学位级别：硕士

本研究应用PCR技术和TaqMar(?)探针实时荧光定量PCR技术,建立猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(pcv-2)单项与三重二温式PCR快速检测方法及单项与三重实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法;探索应用环介导等温扩增(LAMP)技术... 详细信息

本研究应用PCR技术和TaqMar(?)探针实时荧光定量PCR技术,建立猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(pcv-2)单项与三重二温式PCR快速检测方法及单项与三重实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法;探索应用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立简单、灵敏、特异的pcv-2检测方法。所建立检测技术为实验室快速检测上述猪主要DNA病毒提供了可靠的方法,研究分为三个部分：和pcv-2单项及三重二温式PCR方法的建立PPV、PRV一、通过对GenBank登录的PPV、PRV和pcv-2核苷酸序列比对分析,选出PPV的VP2基因、PRV的gH基因和pcv-2的ORF2基因为相对保守区域,利用生物学软件筛选设计出3对高熔解温度特异性引物,目的片段大小分别为142bp(PPV)、300bp (PRV)和469bp (pcv-2)。经条件优化、敏感性试验、特异性试验及重复性试验,建立了单项与三重二温式PCR检测方法。整个三重二温式PCR反应过程约需66min,比三个常规单项PCR分别检测所用总时间减少了近70%,比常规三重PCR节省了至少20%的时间;对三者阳性质粒的检出敏感性低至200拷贝;对其它猪常见病原(副猪嗜血杆菌、链球菌、CSFV、PRRSV、大肠杆菌和JEV)检测无交叉反应;有较好的重复性和稳定性。二、PPV、 PRV和pcv-2单项与三重FQ-PCR检测方法的建立根据TaqMan(?)探针实时荧光定量PCR原理,运用引物、探针设计软件对PPV的VP2基因、PRV的gH基因及pcv-2的ORF2基因分别设计一对引物和一条特异性探针,探针报告集团依次为：JOE (PPV)、TAMARA (PRV)和FAM (pcv-2)。经条件优化、敏感性试验、特异性试验及批内批间重复试验,建立了单项与三重FQ-PCR检测方法。整个反应过程在70min内完成;对阳性质粒的检出敏感性低至10拷贝;对其它猪常见病原检测无交叉反应;批内批间重复试验CV%均小于3%,具有良好重复性;扩增效率E>95%,标准曲线R2>0.99,具有良好的线性关系。三、pcv-2LAMP检测方法的建立根据LAMP技术原理,选取pcv-2的ORF2基因,利用在线Primer Explorer3.0软件设计4条特异性引物。经条件优化、敏感性试验和特异性试验,建立了pcv-2LAMP检测方法。该方法对pcv-2基因组DNA的检出敏感性达0.5pg;对其它猪常见病原检测无交叉反应;阳性扩增产物经酶切验证,为预期条带;反应产物中加入SYBR Green Ⅰ染料,可根据颜色变化,肉眼快速判断结果。用所建立三联PCR方法对205份临床疑似病料样品进行检测,分别与常规单项PCR方法对比。结果显示,单项和三重二温式PCR方法对PPV、PRV和pcv-2检测结果与常规单项PCR方法的总符合率均在97%以上;单项和三重实时荧光定量PCR方法对各相关病原检出率均高于常规单项PCR方法：PPV高出0.38%,PRV高出0.97%,pcv-2高出1.96%。用所建立pcv-2LAMP方法对30份经国标pcv-2检测方法鉴定为阳性的病料DNA进行检测,均能扩增出梯状条带,且阴性对照无扩增,验证了方法的可靠性。

关键词：猪 PPV PRV pcv-2 二温式PCR 三重实时荧光定量PCR LAMP

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表达pcv-2 Cap蛋白主要抗原位点基因重组PPV的构建及其免疫原性研究

表达PCV-2 Cap蛋白主要抗原位点基因重组PPV的构建及其免疫原性研...

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作者：代小芳山东农业大学

学位级别：硕士

猪细小病毒（Porcince parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，以母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等为特征。猪圆环病毒2型（pcv-2）为引起猪断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，并且pcv-2严重... 详细信息

猪细小病毒（Porcince parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，以母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等为特征。猪圆环病毒2型（pcv-2）为引起猪断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，并且pcv-2严重破坏猪的免疫系统，使猪的抵抗力下降，易发生混合或继发感染。在实际生产过程中，PPV和pcv-2常混合或继发感染，相互作用，加重疫病的发展，给生猪的繁殖、发展带来了巨大的经济损失。本研究将猪细小病毒JT株（PPV-JT）同步接种PK-15，提取复制型DNA（RF-DNA），将其分段克隆至pUC18载体，最终构建得到PPV全基因组感染性克隆，命名为pPPV-JT，并进行测序分析。结果，PPV-JT株全基因长4941bp，与GenBank中发表的参考PPV毒株的相应基因序列进行比较，NS1基因的同源性为98.2%～99.9%;NS2基因的同源性为97.9%～100%;NS3基因的同源性为98.5%～100%;VP1基因的同源性为98.6%～99.9%;VP2基因的同源性为98.3%～99.8%。结果表明PPV基因具有相对较高的保守性。系统发生分析表明PPV-JT株的NS1基因与PPV China株的亲缘关系最近，NS2基因及NS3基因与PPV BQ株的亲缘关系最近，但结构蛋白VP1基因和VP2基因与NADL-2株的亲缘关系较为密切。系统发生树分析结果表明PPV-JT株可能是一株新的重组PPV。将PPV-JT株与其同源性最高的NADL-2株基因对比发现，NS1蛋白发生了Trp440Leu突变;VP2蛋白发生了Pro304Ser突变。其中VP2蛋白上的突变位于第4个线性化抗原位点上，可能会影响PPV的抗原性和致病性。PPV-JT NS1蛋白的Thr435和Ser473为其磷酸化位点。PPV-JT的VP2蛋白的378、383和436位氨基酸残基序列及两个127bp的重复序列都与NADL-2株一致，推测PPV-JT株为弱毒株。因细小病毒的基因组小，易于体外操作，并能有效表达外源基因，所以用细小病毒为载体具有较大的优势。将pPPV-JT转染PK-15细胞，能够包装出PPV病毒粒子，经理化性质鉴定、特异性试验和PCR鉴定所获得的拯救病毒与原病毒的生物学特征一致，这为进一步构建以PPV为载体的重组病毒奠定了理论与物质基础。用PCR的方法扩增得到pcv-2Cap蛋白的第276～450bp基因片段，包含ORF2的117～131AA线性化抗原表位，将其克隆至pPPV-JT的Nco I限制性酶切位点处，筛选正确的重组子，命名为pPPV-Cap。利用脂质体介导，将pPPV-Cap转染PK-15细胞，获得重组病毒，命名为PPV-Cap。采用RT-PCR与IFA方法对目的基因进行检测，结果表明，目的基因得到了正确的转录与表达。为检测PPV-Cap的免疫原性，将PPV-Cap免疫接种仔猪，采用ELISA方法检测免疫仔猪的抗PPV和pcv-2的体液免疫水平，结果表明PPV-Cap能够诱导仔猪产生抗PPV和pcv-2的免疫反应，为研究PPV-pcv2重组疫苗提供了实验数据。

关键词： PPV pcv-2 序列分析系统发生树重组疫苗

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pcv-2对自然感染猪群生产性能的影响

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黑龙江畜牧兽医 2017年第24期 119-121页

作者：李瑞香吴奇强付小伟渭南市临渭区动物疾病控制中心渭南市动物疾病控制中心

猪圆环病毒在猪群中感染已较为普遍,但仅有少数猪表现出明显的临床症状,大部分为隐性感染,常常表现为渐进性消瘦、皮肤苍白、腹泻、母猪繁殖障碍等症状,血清流行病学调查结果表明:猪圆环病毒2型(pcv-2)感染呈世界性分布,感染后常造成机... 详细信息

猪圆环病毒在猪群中感染已较为普遍,但仅有少数猪表现出明显的临床症状,大部分为隐性感染,常常表现为渐进性消瘦、皮肤苍白、腹泻、母猪繁殖障碍等症状,血清流行病学调查结果表明:猪圆环病毒2型(pcv-2)感染呈世界性分布,感染后常造成机体免疫系统功能下降[1-3],从而可促使其他病原微生物的并发或者继发感染,使猪群发病率和病死率显著升高,严重制约着养猪业的发展。为充分了解pcv-2对猪群生产性能的影响,量

关键词： pcv-2 自然感染繁殖性能生产性能

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Construction and Immunogenicity of Associated DNA Vaccine of PRRS and pcv-2 Disease

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Agricultural Science & Technology 2009年第2期10卷 108-112,141页

作者：隋慧杨金生辽宁医学院畜牧兽医学院辽宁锦州121001 吉林省兽医科学研究所吉林长春130062

[ Objective ] The aim of the study was to construct associated DNA vaccine of PRRS （Porcine reproductive and respiratory syndrome） and pcv-2 （Porcine circovirus type 2） disease and study its immunogenicity. [ Method] In_ this study, the ORF5 gene of PRRSV isolated in Liaoning was cloned into plRES-neo expression vector, and the neo gene of plRES-neo expression vector was substituted by the ORF2 gene of the pcv-2 Mongolia strain to construct the recombinant expression vector. The expression in BHK cells was detected through Western blot and IFA. Then the ELISA antibody level and the number of spleen T lymphocytes were detected after Balb/c mice were immunized with this DNA vaccine. E Result] The recombinant plasmid plRES-ORF2-ORF5 was constructed successfully and could express the target proteins in BHK cells, as indicated by Western blot and IFA. There was no significant difference in ELISA antibody between plRES-ORF2-ORF5 immunized group and inactived vaccine immunized groups, while the number of spleen T lymphocytes induced by DNA vaccine was higher than that induced by inactived vaccine. [ Conclusion] The recombinant plasmid plRES-ORF2-ORF5 should induce good humoral immune response and cellular immune response in mice, providing the conditions for better prevention and control of PRRS and pcv-2 disease.

关键词： PRRSV pcv-2 Associated DNA vaccine Immunogenicity

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猪圆环病毒(pcv-2型)病与喘气病混合感染的诊治

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中国动物保健 2006年第4期8卷 25-26页

作者：王玉田北京市兽医实验诊断所北京朝阳100101

猪圆环病毒(pcv-2型)病又称为'猪断奶后多系统衰竭综合征'或'断奶仔猪衰竭综合征',是由圆环病毒2型感染所致的病毒性疫病.此病是一种新型的传染病,最早发现并且被确诊于1996年加拿大的西部猪场.十年来在世界各地被陆续发现和报道.由于PC... 详细信息

猪圆环病毒(pcv-2型)病又称为'猪断奶后多系统衰竭综合征'或'断奶仔猪衰竭综合征',是由圆环病毒2型感染所致的病毒性疫病.此病是一种新型的传染病,最早发现并且被确诊于1996年加拿大的西部猪场.十年来在世界各地被陆续发现和报道.由于pcv-2的致病性独特,现阶段对于圆环病毒还没有完全研究清楚,也不可能在短时间内研制出有效的疫苗和治疗药物,但是目前猪群带毒感染情况非常普遍.猪喘气病是由猪肺炎支原体(MH)引起的一种高度接触性传染病,又称猪支原体肺炎或猪地方流行性肺炎,主要临床症状是咳嗽和气喘,是一种常发病.猪圆环病毒(pcv-2型)病与喘气病混合感染发病时往往造成经济损失巨大.笔者通过对一起猪圆环病毒(pcv-2型)病与喘气病病例的诊治,阐述其防治方法.