PPV、PRV和PCV-2三重PCR与PCV-2 LAMP检测方法的建立及初步应用

作     者：申世川 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王一成;姜平

授予年度：2012年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪 PPV PRV PCV-2 二温式PCR 三重实时荧光定量PCR LAMP 

摘      要：本研究应用PCR技术和TaqMar(?)探针实时荧光定量PCR技术,建立猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)单项与三重二温式PCR快速检测方法及单项与三重实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法;探索应用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立简单、灵敏、特异的PCV-2检测方法。所建立检测技术为实验室快速检测上述猪主要DNA病毒提供了可靠的方法,研究分为三个部分： 和PCV-2单项及三重二温式PCR方法的建立PPV、PRV一、 通过对GenBank登录的PPV、PRV和PCV-2核苷酸序列比对分析,选出PPV的VP2基因、PRV的gH基因和PCV-2的ORF2基因为相对保守区域,利用生物学软件筛选设计出3对高熔解温度特异性引物,目的片段大小分别为142bp(PPV)、300bp (PRV)和469bp (PCV-2)。经条件优化、敏感性试验、特异性试验及重复性试验,建立了单项与三重二温式PCR检测方法。整个三重二温式PCR反应过程约需66min,比三个常规单项PCR分别检测所用总时间减少了近70%,比常规三重PCR节省了至少20%的时间;对三者阳性质粒的检出敏感性低至200拷贝;对其它猪常见病原(副猪嗜血杆菌、链球菌、CSFV、PRRSV、大肠杆菌和JEV)检测无交叉反应;有较好的重复性和稳定性。 二、PPV、 PRV和PCV-2单项与三重FQ-PCR检测方法的建立 根据TaqMan(?)探针实时荧光定量PCR原理,运用引物、探针设计软件对PPV的VP2基因、PRV的gH基因及PCV-2的ORF2基因分别设计一对引物和一条特异性探针,探针报告集团依次为：JOE (PPV)、TAMARA (PRV)和FAM (PCV-2)。经条件优化、敏感性试验、特异性试验及批内批间重复试验,建立了单项与三重FQ-PCR检测方法。整个反应过程在70min内完成;对阳性质粒的检出敏感性低至10拷贝;对其它猪常见病原检测无交叉反应;批内批间重复试验CV%均小于3%,具有良好重复性;扩增效率E95%,标准曲线R20.99,具有良好的线性关系。 三、PCV-2LAMP检测方法的建立 根据LAMP技术原理,选取PCV-2的ORF2基因,利用在线Primer Explorer3.0软件设计4条特异性引物。经条件优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV-2LAMP检测方法。该方法对PCV-2基因组DNA的检出敏感性达0.5pg;对其它猪常见病原检测无交叉反应;阳性扩增产物经酶切验证,为预期条带;反应产物中加入SYBR Green Ⅰ染料,可根据颜色变化,肉眼快速判断结果。 用所建立三联PCR方法对205份临床疑似病料样品进行检测,分别与常规单项PCR方法对比。结果显示,单项和三重二温式PCR方法对PPV、PRV和PCV-2检测结果与常规单项PCR方法的总符合率均在97%以上;单项和三重实时荧光定量PCR方法对各相关病原检出率均高于常规单项PCR方法：PPV高出0.38%,PRV高出0.97%,PCV-2高出1.96%。用所建立PCV-2LAMP方法对30份经国标PCV-2检测方法鉴定为阳性的病料DNA进行检测,均能扩增出梯状条带,且阴性对照无扩增,验证了方法的可靠性。