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pcr-hrm for Genomic Surveillance of SARS-CoV-2: A Variant Detection Tool in Côte d’Ivoire, West Africa

American Journal of Molecular Biology 2024年第3期14卷 166-185页

作者： Aboubacar Sylla Solange Kakou-Ngazoa Tata Gniré Safiatou Coulibaly Yakoura Karidja Ouattara Mireille Sylvie Kouamé-Sina Zeinab Ouattara David Ngolo Coulibaly Brice Kouakou Bla Mireille Dosso Molecular Biology Platform Pasteur Institute Cte dIvoire Abidjan Cte dIvoire Laboratory of Biology and Health UFR Biosciences University Flix Houphout Boigny Abidjan Cte dIvoire Genetic and Cancer Laboratory Molecular Genetics Platform Pasteur Institute Cte dIvoire Abidjan Cte dIvoire Epidemic Virus Department Pasteur Institute Cte dIvoire Abidjan Cte dIvoire

The rise of new viruses, like SARS-CoV-2 causing the COVID-19 outbreak, along with the return of antibiotic resistance in harmful bacteria, demands a swift and efficient reaction to safeguard the health and welfare of the global population. It is crucial to have effective measures for prevention, intervention, and monitoring in place to address these evolving and recurring risks, ensuring public health and international security. In countries with limited resources, utilizing recombinant mutation plasmid technology in conjunction with pcr-hrm could help differentiate the existence of novel variants. cDNA synthesis was carried out on 8 nasopharyngeal samples following viral RNA extraction. The P1 segment of the SARS-CoV-2 Spike S protein was amplified via conventional pcr. Subsequently, pcr products were ligated with the pGEM-T Easy vector to generate eight recombinant SARS-CoV-2 plasmids. Clones containing mutations were sequenced using Sanger sequencing and analyzed through pcr-hrm. The P1 segment of the S gene from SARS-CoV-2 was successfully amplified, resulting in 8 recombinant plasmids generated from the 231 bp fragment. pcr-hrm analysis of these recombinant plasmids differentiated three variations within the SARS-CoV-2 plasmid population, each displaying distinct melting temperatures. Sanger sequencing identified mutations A112C, G113T, A114G, G214T, and G216C on the P1 segment, validating the pcr-hrm findings of the variations. These mutations led to the detection of L452R or L452M and F486V protein mutations within the protein sequence of the Omicron variant of SARS-CoV-2. In summary, pcr-hrm is a vital and affordable tool for distinguishing SARS-CoV-2 variants utilizing recombinant plasmids as controls.

关键词： Genomic Surveillance SARS-CoV-2 pcr-hrm Variants Côte d’Ivoire

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两广地区新城疫流行病学监测及区分Ⅰ和Ⅱ类NDV的pcr-hrm检测方法的建立

两广地区新城疫流行病学监测及区分Ⅰ和Ⅱ类NDV的PCR-HRM检测方法...

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作者：宋洁华南农业大学

学位级别：硕士

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中的强毒株引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。鸡和多种禽类感染后可导致较高发病率和死亡率,对全球的家禽养殖业造成严重的经济损失。我国将其作... 详细信息

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中的强毒株引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。鸡和多种禽类感染后可导致较高发病率和死亡率,对全球的家禽养殖业造成严重的经济损失。我国将其作为一类疫病列入国家中长期动物疫病防治规划当中。两广地区家禽和水禽养殖业发达,禽肉类食品的市场需求量大,活禽交易市场多,且位于我国南部,气候湿润,植被种类丰富,有多条候鸟迁徙路线,在此多因素背景的存在下,无疑为NDV创造了更加有利的传播条件。因此,本研究在2017～2019年期间,进行了广东省NDV的流行病学调查及两广地区健康禽群和环境中NDV的监测工作。在流行病学调查中,用常规的病毒分离鉴定的方法共分离出4株NDVs,均为ClassⅡNDV,其中2株为基因Ⅸ型NDVs,2株为基因Ⅱ型,总的阳性分离率为0.19%。调查统计结果显示,从宿主分布看,NDV在水禽中的阳性分离率较高（0.83%）,其次为家禽（0.31%）;从来源分布看,NDV在动物园中的阳性分离率为最高（1.16%）,其次为家禽养殖场（0.26%）。在对两广地区健康禽群及环境中NDV的监测过程中,鉴定出80株NDVs,其中ClassⅠ-1b亚型77株,占阳性分离样品的96.25%,阳性分离率为5.02%;3株ClassⅡ基因Ⅱ型NDVs,占阳性分离样品的3.75%,阳性分离率为0.20%。以上的调查及监测结果表明,当前ClassⅠNDV较广泛地存在于活禽交易市场和家禽养殖场中,ClassⅡNDV的阳性分离率较低,但仍然存在,且宿主分布较广,而常规的病毒分离鉴定的方法费时、费力,灵敏性相对较差,且难以进行高通量检测。基于此,本研究通过多序列比对分析,根据ClassⅠ和ClassⅡNDV的P基因阅读框的碱基数差异,在其上下游相对保守区域设计了一对用于检测的扩增引物NDV P1-F和NDV P1-R,首次利用hrm分析技术成功建立了区分ClassⅠ和ClassⅡNDV的高分辨率熔解曲线的检测方法（pcr-hrm）。该方法兼具特异性强、灵敏度高和稳定性好等优点,其对非NDV的多种禽类病毒均无阳性扩增结果,最低检测线可达22.5copies/μL（ClassⅠ）和26.2 copies/μL（ClassⅡ）,且样品熔解温度的批内差异在0.00℃～0.13℃之间,批间差异在0.03℃～0.28℃之间。使用此方法进行检测时,可实现从pcr扩增到hrm结果判定的全程闭管操作,相比于常规核酸电泳大大降低了交叉污染的风险,且耗时短、操作简便,可同时进行384个样品的检测,根据ClassⅠ和ClassⅡNDV的熔解温度区间即可对临床样品进行鉴别。综上所述,本研究通过对广东省NDV流行病学调查和两广地区健康禽群及环境中NDV的监测,了解了当前存在于养殖场、活禽市场及野鸟中NDV的流行情况,进而建立了区分ClassⅠ和ClassⅡNDV的高分辨率熔解曲线的检测方法,为快速鉴别临床样品中两类NDV提供了检测手段。

关键词：新城疫病毒流行 ClassⅠ ClassⅡ pcr-hrm

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基于hrm技术建立胃癌和RA关联基因SNP位点分子诊断方法

基于HRM技术建立胃癌和RA关联基因SNP位点分子诊断方法

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作者：杨美娟兰州大学

学位级别：硕士

目的建立胃癌关联基因SNP位点(rs13361707(PRKAA1)、rs9841504(ZBTB20))和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)关联基因SNP位点(rs7574865(STAT4)、rs7234029(PTPN2)、rs2233945(PSORS1C1)及rs33980500(TRAF3IP2))的聚合酶链式反应-高分辨熔解(polymerase chain reaction-high resolution melting,pcr-hrm)分子诊断方法,并评价其检测性能。同时探究rs7574865、rs7234029、rs2233945及rs33980500多态性与兰州地区汉族人群RA易感的相关性。方法通过查阅相关文献获取rs13361707、rs9841504的引物,同时使用在线软件Primer-BLAST设计rs13361707、rs9841504、rs7574865、rs7234029、rs2233945及rs33980500 6个位点的特异性引物,建立胃癌和RA关联基因SNP位点的pcr-hrm分子诊断方法。以Sanger测序作为金标准评价其特异性和敏感度;通过重复性试验评价其重复性和再现性;稳健性评价主要考察6个主要因素(引物浓度变化、反应体系量的变化、DNA模板浓度变化、pcr扩增循环数变化、不同荧光染料、仪器类型)对pcr-hrm检测的影响。并对280例标本进行基因分型以评价其临床适用性。结果(1)自建的rs13361707、rs9841504、rs7574865、rs7234029、rs2233945及rs33980500 6个位点的pcr-hrm分子诊断方法能够准确基因分型,且测序结果验证显示该方法的特异性和敏感度可达100%;6个位点的重复性和再现性测试结果显示Tm的变异系数范围为(0.01%-0.07%)与(0.02%-0.05%)。引物浓度(0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L)、反应体系量的变化(10μl、15μl、20μl)、DNA模板浓度的变化(10ng/μl、20ng/μl、50ng/μl、100ng/μl)、PC R扩增循环数变化(38、40、42循环)、饱和荧光染料种类(LC Green染料、Syto 13染料、Eva Green染料)和仪器类型(Rotor-Gene 6000、Roche LightCy cler?480、Roche LightCycler?96)等因素均对该方法基因分型无明显影响。(2)rs2233945和rs7574865位点在RA组和对照组的基因型频率差异有统计学意义(x=13.063,P=1.45×10;x=31.044,P=1.81×10)。在显性模型下,rs2233945 A基因(杂合型CA和纯合突变型AA)携带者患RA的风险明显降低(OR=0.481,95%CI:0.222-0.081,Ppcr-hrm分子诊断方法在方法学上是可靠的,且适用于临床常规化检测。rs7574865和rs2233945多态性与兰州汉族人群RA易感性相关。

关键词： pcr-hrm 单核苷酸多态性胃癌类风湿性关节炎 PRKAA1 ZBTB20 STAT4 PTPN2 PSORS1C1 TRAF3IP2

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兔艾美耳球虫hrm鉴别方法的建立

兔艾美耳球虫HRM鉴别方法的建立

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作者：叶英娣华南农业大学

学位级别：硕士

兔球虫病是由多种艾美耳属球虫寄生于家兔肝胆管及肠上皮细胞内所引起的寄生性原虫病。该病是家兔常见的危害最严重的寄生虫病,幼兔感染率为100%,临床症状主要表现为腹泻或肝脏结节性坏死。兔艾美耳球虫可分为11种,其中斯氏艾美耳球虫... 详细信息

兔球虫病是由多种艾美耳属球虫寄生于家兔肝胆管及肠上皮细胞内所引起的寄生性原虫病。该病是家兔常见的危害最严重的寄生虫病,幼兔感染率为100%,临床症状主要表现为腹泻或肝脏结节性坏死。兔艾美耳球虫可分为11种,其中斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫具有高致病性。为了准确鉴别兔球虫种类,本研究以ITS1序列作为遗传标志设计引物,建立6种球虫的pcr-hrm鉴别方法,为兔球虫的分子检测及未来兔球虫疫苗株的检测提供技术储备。本论文采用pcr-hrm方法对兔的大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫和维氏艾美耳球虫等6种常见球虫进行了鉴别诊断。结果显示,引物ITS1-F/ITS1-R能明确区分大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫和维氏艾美耳球虫。在对pcr-hrm鉴别方法的重复性、敏感性、特异性试验中,批内和批间重复性均良好;对于大型艾美耳球虫和黄艾美耳球虫,pcr-hrm方法可检出的最低浓度为1.5 copy/μL,中型艾美耳球虫的最低检测浓度为14.4 copy/μL,肠艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫和维氏艾美耳球虫的最低检测浓度分别为139 copy/μL、142 copy/μL和166 copy/μL;特异性检测中,引物ITS1-F/ITS1-R特异性好,只能扩增出6种兔艾美耳球虫阳性标准品的特异熔解曲线,而对兔的常见疫病病原,如兔病毒性出血症病毒(RHDV)、兔轮状病毒(La RV)、兔源大肠杆菌(***)、兔源巴氏杆菌(***)均不能扩增。结果表明,建立的hrm鉴别方法具有快速、稳定、敏感和特异的特点,可适用于6种兔球虫的检测。

关键词：兔艾美耳球虫 pcr-hrm 鉴别

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基于高分辨率熔解曲线技术鉴别猪流行性腹泻病毒弱毒株与野毒株的方法

基于高分辨率熔解曲线技术鉴别猪流行性腹泻病毒弱毒株与野毒株的...

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第十三届中国实验动物科学年会

作者：饶丹丛锋朱余军练月晓肖丽黄韧张钰郭鹏举陈梅丽广东省实验动物重点实验室广东省实验动物监测所

目的建立一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒弱毒株与野毒株的方法。方法基于新型的pcr后分析技术-高分辨率熔解曲线(hrm),大量分析PEDV全基因序列的特点,建立鉴别PEDV CV77疫苗株与野毒株的pcr-hrm分析方法。在ORF1保守区域设计和筛选用于... 详细信息

目的建立一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒弱毒株与野毒株的方法。方法基于新型的pcr后分析技术-高分辨率熔解曲线(hrm),大量分析PEDV全基因序列的特点,建立鉴别PEDV CV77疫苗株与野毒株的pcr-hrm分析方法。在ORF1保守区域设计和筛选用于区分弱毒与野毒株的引物,同时用普通的RT-pcr方法进行对比。结果能够很好的区分弱毒疫苗株与野毒参照株,特异性试验中其他非PEDV病毒无扩增;同时检测19份临床样品中,pcr-hrm方法检测均为阳性且鉴定为野毒株,普通RT-pcr后凝胶电泳分析检测18份阳性,为野毒株。结论 pcr-hrm方法具有特异性好,灵敏度高,pcr后无需开盖分析,极大的避免了污染问题,是一种新型的鉴别检测方法。

关键词： PEDV 疫苗株野毒株 pcr-hrm

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hrm技术在瘦素基因启动子多态性与肝硬化发生相互关系研究中的应用

HRM技术在瘦素基因启动子多态性与肝硬化发生相互关系研究中的应用

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第二十四届全国中西医结合消化系统疾病学术会议

作者：李善高曹海军刘军徐国萍孙明洪朱孝鸿吕宾孟立娜浙江中医药大学附属第一医院消化内科中国计量学院生命科学学院浙江中医药大学附属第一医院检验科浙江中医药大学附属第一医院肝病科

目的:探讨pcr-hrm(聚合酶链式反应-高分辨率熔点曲线)技术筛选和分析肝硬化患者瘦素基因启动子C2549和G2548位点突变的可能性,同时研究突变基因型与肝硬化患者生理生化指标之间的关系。方法:采用pcr-hrm新型技术,同时对比传统方法pcr-RF... 详细信息

目的:探讨pcr-hrm(聚合酶链式反应-高分辨率熔点曲线)技术筛选和分析肝硬化患者瘦素基因启动子C2549和G2548位点突变的可能性,同时研究突变基因型与肝硬化患者生理生化指标之间的关系。方法:采用pcr-hrm新型技术,同时对比传统方法pcr-RFLP(聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析),对对照组(n=100)和肝硬化组(n=100)瘦素基因启动子C2549和G2548位点突变进行分析,同时检测生理生化指标。结果:1)pcr-hrm技术能够有效、高通量、准确的实现对瘦素基因启动子多态性的检测分析2)肝硬化患者瘦素基因启动子主要突变位点在C2549,而G2548位点没有发现突变;3)肝硬化组中瘦素(OB)、游离瘦素指数(FLI)、空腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR高于对照组,胰岛素敏感指数(ISI)及可溶性瘦素受体(sOB-R)低于对照组,除OB外,均有显著性差异(Ppcr-hrm能准确及高通量的实现对瘦素基因启动子多态性进行分析,并验证了A位点基因频率的增高可能和肝硬化发生有关;肝硬化患者存在高胰岛素血症及胰岛素抵抗,OB可能与肝硬化患者胰岛素抵抗发生有关。

关键词： pcr-hrm 瘦素基因启动子多态性肝硬化

来源： cnki会议评论

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