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中国老年学杂志 2021年第24期41卷 5672-5677页

作者：刘文选淄博市第一医院皮肤科山东淄博255200

目的探讨白花蛇舌草多糖(HDP)对皮肤鳞癌细胞A431增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪法分别检测不同浓度HDP对A431细胞增殖和凋亡的影响,Transwell法检测HDP对A431细胞迁移和侵袭的影响,qRT-PCR检测... 详细信息

目的探讨白花蛇舌草多糖(HDP)对皮肤鳞癌细胞A431增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪法分别检测不同浓度HDP对A431细胞增殖和凋亡的影响,Transwell法检测HDP对A431细胞迁移和侵袭的影响,qRT-PCR检测HDP对A431细胞中miR-21-5p表达的影响,构建抑制表达miR-21-5p的A431细胞并分析抑制miR-21-5p表达后细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力变化,构建过表达miR-21-5p和抑制表达pag1的A431细胞并分析HDP对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果与Con组比较,HDP 200μg/ml组A431细胞中miR-21-5p相对表达量显著降低(P1-5p组A431细胞中miR-21-5p相对表达量显著降低(P1、Bcl-2蛋白表达显著降低(P1、Bax蛋白表达显著升高(P1-5p组A431细胞中miR-21-5p相对表达量显著升高(P1、Bcl-2蛋白表达显著升高(P1、Bax蛋白表达显著降低(P1-5p/pag1表达有关。

关键词：皮肤鳞癌白花蛇舌草多糖 miR-21-5p pag1 增殖凋亡迁移侵袭

pag1棕榈酰化位点突变与皮肤鳞状细胞癌的相关性研究

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PAG1棕榈酰化位点突变与皮肤鳞状细胞癌的相关性研究

作者：高潇青岛大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探讨富含鞘磷脂的脂膜微区结合酪氨酸磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains,pag),人源性称为pag1。棕榈酰化位点突变(即C-X-X-C突变为A-X-X-A)对皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)A431细胞系生物学行为的影响,并进一步研究棕榈酰化位点突变的pag1与Src信号传递中相关调控分子的相关性及其分子机制。方法:通过Uniprot蛋白数据库查询pag1分子结构,选择将pag1棕榈酰化位点中的半胱氨酸突变为丙氨酸,选用A431细胞系为研究对象,用携带增强绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的过表达野生型pag1和棕榈酰化位点突变的pag1以及仅含有增强绿色荧光的慢病毒载体转染A431细胞,建立了稳定过表达野生型pag1的A431细胞株(WT-pag1组)、过表达pag1棕榈酰化位点突变的A431细胞株(mutant-pag1组)以及只带有绿色荧光的阴性对照组(control组)和未经处理的空白对照组(parental组)。用激光共聚焦显微镜检测经慢病毒转染后WT-pag1组、mutant-pag1组以及control组细胞中绿色荧光的表达情况;用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测扩大培养后细胞转染率,用分选FCM分选3组细胞中携带绿色荧光的细胞,并采用有限稀释法筛选获得单克隆目的细胞系并扩大培养。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)法检测细胞内pag1 mRNA的表达水平;蛋白印迹法(Western blot)检测细胞内pag1蛋白的表达水平;用细胞增殖实验CCK8法检测A431细胞的增殖能力;Annexin V-APC/PI双染法检测棕榈酰化位点突变对A431细胞凋亡的影响;划痕实验和Transwell迁移检测A431细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验检测A431细胞的侵袭能力。Western Blot检测与pag1结合的抑制性酪氨酸激酶Csk以及Src活化信号通路中重要的信号分子Fyn的表达水平。结果:(1)在经慢病毒转染96h后,用激光共聚焦显微镜观察WT-APG1、mutant-pag1以及control组绿色荧光几乎遍布整个视野;FCM检测经慢病毒转染后,3组细胞携带荧光的阳性率,结果显示control组,WT-pag1组以及mutant-pag1组的荧光阳性率分别为86.2%、88.1%及87.8%,随后用RT-PCR检测细胞中pag1基因mRNA的表达水平,结果显示,WT-pag1组和mutant-pag1组中pag1基因mRNA的表达量分别为parental组的1.65和1.68倍,差异具有统计学意义(Ppag1蛋白的表达水平,结果显示,与control组相比,WT-pag1组和mutant-pag1组转染后pag1蛋白的表达量分别为control组的2.17和2.24倍,与parental组相比差异具有统计学意义(Ppag1组细胞增殖明显减弱,在2-6天组间的差异具有统计学意义(Ppag1组与parental组和control组A431细胞相比差异没有统计学差异(P>0.05),说明pag1能明显抑制A431细胞系的增殖,而棕榈酰化位点突变的pag1丧失了抑制细胞增殖的能力。(3)细胞凋亡结果显示,parental组和control组的凋亡率分别为5.30%±0.04%和4.20%±0.06%,WT-pag1的A431细胞凋亡明显增加,凋亡率为11.20%±0.04%,与parental和control组相比差异具有统计学意义(Ppag1组A431细胞的凋亡率为3.50%±0.04%,与parental和control组相比没有统计学差异(P>0.05)。(4)划痕修复实验结果显示,与parental组和control组相比,WT-pag1组细胞愈合能力明显降低(Ppag1组与parental组和control组相比没有统计学差异(P>0.05);Tranwell迁移实验结果表明,WT-pag1组细胞的迁移能力与parental和control组相比明显降低。与WT-pag1组相比,mutant-PA

关键词：皮肤鳞状细胞癌 pag1 棕榈酰化位点生物学行为

跨膜接头蛋白pag1过表达对皮肤鳞癌细胞A431运动能力的影响

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肿瘤防治研究 2016年第9期43卷 738-742页

作者：李美佳王冰毛凯平渠开攀张维娜青岛大学附属医院烧伤整形外科青岛266000 青岛大学医学院免疫教研室青岛266000 青岛市市立医院(集团)胸外科青岛266000

目的研究跨膜接头蛋白pag1过表达对人皮肤鳞状细胞癌A431运动能力的影响。方法构建pag1-EGFP融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立pag1过表达的A431细胞株,实验分为3组:亲本细胞组(未进行基因转染的A431细胞)、对照组... 详细信息

目的研究跨膜接头蛋白pag1过表达对人皮肤鳞状细胞癌A431运动能力的影响。方法构建pag1-EGFP融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立pag1过表达的A431细胞株,实验分为3组:亲本细胞组(未进行基因转染的A431细胞)、对照组(A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒)、实验组(A431细胞转染pag1-EGFP病毒)。流式细胞术检测细胞转染率,实时荧光定量PCR及Western blot检测转染后pag1 mRNA及其蛋白表达,进一步验证细胞转染成功与否;利用划痕修复实验、Transwell迁移实验、侵袭实验三种不同的方法检测pag1基因的过表达是否会对皮肤鳞癌细胞的生长、迁移和侵袭能力产生影响。结果实验组和对照组目的基因病毒的转染表达率分别为(94.97±0.15)%、(94.60±0.35)%;实验组细胞中pag1基因m RNA的表达量约为亲本细胞组的1.6倍(P=0.000),转染后实验组中pag1蛋白的相对表达水平明显增加(P=0.000),建立了稳定过表达pag1的A431细胞系;pag1过表达明显降低A431细胞愈合率(P=0.000);实验组A431细胞迁移、侵袭能力明显降低(P=0.001,P=0.000)。结论 pag1的过表达能抑制人皮肤鳞癌细胞运动能力,影响肿瘤的浸润及远处转移。

关键词：皮肤鳞癌 pag1 迁移侵袭

抑制pag1表达对人喉鳞癌Hep-2细胞原发性放射抗拒的影响及机制研究

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抑制PAG1表达对人喉鳞癌Hep-2细胞原发性放射抗拒的影响及机制研究

作者：柴晶晶湖北医药学院

学位级别：硕士

背景:人喉鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,人喉鳞癌细胞的放疗抵抗是其放疗失败的根本原因。本课题组成员前期已成功构建原发性喉鳞癌放射抗拒细胞模型Hep-2max及原发性喉鳞癌放射敏感细胞模型Hep-2min,并证实鞘糖脂微结构域1相关磷... 详细信息

背景:人喉鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,人喉鳞癌细胞的放疗抵抗是其放疗失败的根本原因。本课题组成员前期已成功构建原发性喉鳞癌放射抗拒细胞模型Hep-2max及原发性喉鳞癌放射敏感细胞模型Hep-2min,并证实鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains 1,pag1)介导人喉鳞癌原发性放射抗拒性状,但其机制还未明确。目的:本课题中我们将研究干扰pag1对人喉鳞癌原发性放射抗拒细胞Hep-2max放射敏感性的影响,并初步探究其作用机制。方法:选用克隆形成试验验证本课题组成员前期构建的细胞模型的放射敏感性差异;采用荧光定量RT-PCR法检测pag1及STAT3 mRNA的表达情况;采用Western Blot检测相关蛋白的表达变化;采用pag1基因的干扰质粒shpag1,阴性质粒shNC转染人喉鳞癌原发性放射抗拒细胞株Hep-2max,嘌呤霉素筛选转染的细胞株;采用流式细胞术检测干扰pag1表达,经8Gy射线照射后细胞凋亡及细胞周期的变化情况,最后根据克隆形成实验结果判断细胞对射线的敏感程度。结果:克隆形成试验证实,前期本课题组成员构建的细胞模型Hep-2max与Hep-2min具有明显的放射敏感性差异。荧光定量RT-PCR结果显示,pag1及STAT3 mRNA在Hep-2max中的表达高于Hep-2min。Western blot实验表明,pag1及STAT3蛋白在Hep-2max中的表达高于其在Hep-2min中的表达。成功构建干扰pag1表达喉鳞癌细胞株。荧光定量RT-PCR及Western blot实验表明,在人喉鳞癌原发性放射抗拒细胞中,干预pag1表达可降低STAT3 mRNA及蛋白的表达。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,8Gy射线照射后,pag1干扰组细胞凋亡比例较阴性质粒对照组明显增加,pag1干扰组G2/M期细胞所占比例大于阴性质粒对照组,差异均有统计学意义(P>0.05)。最终,克隆形成实验结果证实,干扰pag1表达可增加喉癌细胞对放射线的敏感性。结论:干扰pag1表达可逆转喉鳞癌细胞的原发性放射抗拒,增加喉癌细胞放射敏感性,其机制可能与调控STAT3的表达、改变细胞周期分布、促进细胞凋亡有关,可能是喉鳞癌放疗增敏的潜在靶点。

关键词：喉癌放射治疗 pag1 原发性放射抗拒性

基于妊娠相关糖蛋白pag1的奶牛妊娠诊断技术研究

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基于妊娠相关糖蛋白PAG1的奶牛妊娠诊断技术研究

作者：邓亮吉林大学

学位级别：硕士

能否及早且准确地诊断出奶牛的妊娠状况是奶牛养殖的关键。奶牛受精后19-20 d(day)胚胎开始着床,大约在42 d完成这个进程。胚胎着床后会产生一些物质,能通过循坏系统到达母体各种体液中。这样从母体体液中检测某些分子来诊断妊娠状态就... 详细信息

能否及早且准确地诊断出奶牛的妊娠状况是奶牛养殖的关键。奶牛受精后19-20 d(day)胚胎开始着床,大约在42 d完成这个进程。胚胎着床后会产生一些物质,能通过循坏系统到达母体各种体液中。这样从母体体液中检测某些分子来诊断妊娠状态就有了可能。而且着床之后,胚胎与母体子宫获得了联系,变得更为稳定和安全,较少再发生流产。所以人工授精(Artificial Insemination,AI)后的20-42 d是奶牛早期诊断的最合适的时间段。在着床过程中,许多细胞因子起着重要的调控作用,这些细胞因子也是潜在的妊娠诊断标记物。妊娠相关糖蛋白(Pregnancy Associated Glycoproteins,pags)在偶蹄类动物的妊娠阶段血清中的成周期性的变化,尽管pags在功能上的研究还不是很明确,但作为早期妊娠诊断标记分子已有大量研究。本课题选择妊娠相关糖蛋白pag1为标记分子,以期建立一种ELISA试剂盒。首先,依据pag1氨基酸序列,选出一段GTPPQEFQVC合成多肽;并与KLH偶联用于动物免疫,与BSA偶联用户筛选单克隆细胞;并命名为2017-020-KLH和2017-020-BSA。免疫4只BALB/c雌性小鼠,眼眶采血测效价,选择效价最高的小鼠(效价为12800)。之后取该小鼠脾脏细胞与小鼠骨细胞瘤SP2/0细胞,采用PEG法进行融合。融合后的细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养;用ELISA方法分两次筛选阳性单克隆细胞,选出4株阳性单克隆细胞1、3、7、12号;对这几株单克隆细胞进行抗体亚型鉴定,显示分别为IgG、IgM、IgG、IgM;选择IgG的1、7号进行进一步扩繁,并对细胞培养上清用Western Blotting(WB)进行抗体特异性鉴定。分别用妊娠35 d以上的奶牛血清、HEK293细胞过表达pag1和过表达pag1加PNGase F去糖基酶进行WB。对特异性优良两株阳性杂交瘤细胞,注入小鼠腹腔,收集腹水,再从腹水中提取单克隆抗体,再进行纯化。之后,利用选取的单克隆抗体建立双抗夹心ELISA。经过条件选择后,采集奶牛血清AI 15 d后27份和AI 30 d后29份分别进行检测,与AI后2个月的B超监测结果对比,在AI 15 d后,阳性符合率为75%,阴性符合率为72.7%,总符合率为74.1%;AI 30d后,阳性符合率为91.3%,阴性符合率为83.3%,总符合率为89.7%。

关键词： pag1 奶牛妊娠诊断 ELISA

pag1与整合素β1的相互作用及其位点分析

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湖北医药学院学报 2018年第3期37卷 199-202,F0002页

作者：沈力彭峰柯青邱力湖北医药学院基础医学院生物化学教研室十堰市太和医院.湖北医药学院附属医院肿瘤防治中心湖北十堰442000

目的:在原发性放射抵抗喉癌细胞中分析鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(pag1)与整合素β1的相互作用情况,并探讨pag1与整合素β1的结合基序。方法:提取Hep-2max细胞总蛋白,采用免疫共沉淀技术检测pag1、整合素β1相互作用;进一步运用多... 详细信息

目的:在原发性放射抵抗喉癌细胞中分析鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(pag1)与整合素β1的相互作用情况,并探讨pag1与整合素β1的结合基序。方法:提取Hep-2max细胞总蛋白,采用免疫共沉淀技术检测pag1、整合素β1相互作用;进一步运用多肽阵列技术在聚乙二醇(PEG)修饰纤维素膜上合成覆盖pag1蛋白全部序列的多肽阵列,包含7个重复氨基酸,多肽长度为12个氨基酸,将阵列与整合素β1重组蛋白孵育,通过整合素β1特异抗体检测,使用TotalLab软件分析各点光密度。结果:pag1免疫沉淀复合物中检测到整合素β1,整合素β1免疫沉淀复合物中检测到pag1;pag1多肽阵列两个区域存在阳性结合反应,分别位于Pro^(216)-Arg^(232)和Asn^(356)-Gly^(377)之间。结论:pag1与整合素β1的相互结合在喉癌原发性放射抵抗中发挥重要作用。

关键词： pag1 整合素β1 多肽阵列结合基序

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pag1相互作用蛋白的筛选和验证

湖北医药学院学报 2017年第3期36卷 195-198,F0003页

作者：刘甜甜沈力柴晶晶宫梦晓柯青骆志国十堰市太和医院.湖北医药学院附属医院肿瘤防治中心湖北十堰442000 锦州医科大学十堰市太和医院研究生培养基地辽宁锦州121001 湖北医药学院基础医学院生物化学教研室湖北十堰442000

目的:在原发性放射抗拒喉癌细胞中筛选鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(pag1)的相互作用蛋白并验证其相互作用情况。方法:采用免疫沉淀技术通过特异抗体富集pag1结合蛋白,SDS-pagE对免疫沉淀复合物进行分离,从胶中切取pag1结合蛋白条带,... 详细信息

目的:在原发性放射抗拒喉癌细胞中筛选鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(pag1)的相互作用蛋白并验证其相互作用情况。方法:采用免疫沉淀技术通过特异抗体富集pag1结合蛋白,SDS-pagE对免疫沉淀复合物进行分离,从胶中切取pag1结合蛋白条带,质谱鉴定其成分,NCBI数据库检索各个蛋白功能,进一步运用免疫荧光双标法验证互作蛋白。结果:利用免疫沉淀联合质谱分析筛选得到包括整合素β1在内的9个候选蛋白质,免疫荧光双标法证实pag1与整合素β1能共定位。结论:原发性放射抗拒喉癌细胞中pag1与整合素β1存在相互作用,为进一步研究pag1功能奠定基础。

关键词： pag1 整合素β1 原发性放射抗拒喉癌

MiRNA-218对pag1的调控及其对卵巢癌干细胞的影响

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临床与病理杂志 2019年第4期39卷 706-713页

作者：贺敏陈勇伟曾康康郑蓉十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)妇产科湖北十堰442700 十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)泌尿外科湖北十堰442700

目的:研究miR-218在卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells,OCSCs)中的表达,并探讨其对pag1的调控作用和对OCSCs的影响及作用机制。方法:收集卵巢癌患者新鲜肿瘤组织,分离培养原代卵巢癌细胞,用流式细胞仪筛选出CD133^+表型的OCSCs。... 详细信息

目的:研究miR-218在卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells,OCSCs)中的表达,并探讨其对pag1的调控作用和对OCSCs的影响及作用机制。方法:收集卵巢癌患者新鲜肿瘤组织,分离培养原代卵巢癌细胞,用流式细胞仪筛选出CD133^+表型的OCSCs。采用Western印迹法检测干性特异相关基因Nanog和Sox2蛋白的表达。qRT-PCR检测miR-218在OCSCs中的表达。miR-218 mimic转染OCSCs,分为miR-218mimic组和miR-218NC组,MTS检测各组OCSCs增殖;软琼脂克隆实验检测各组OCSCs肿瘤球形成能力的影响;miR-218过表达慢病毒质粒及对照质粒vector感染OCSCs,经1.0μg/mL嘌呤霉素筛选稳定过表达miR-218或vector的OCSCs细胞,注射到BALB/c裸鼠中,观察miR-218对OCSCs体内成瘤能力的影响。Targetscan7.2预测软件及双荧光素酶报道基因试验,分析miR-218对pag1基因的靶向作用,qRT-PCR检测miR-218mimic组和miR-218NC组OCSCs中pag1mRNA的表达。Western印迹法检测miR-218mimic组和miR-218NC组OCSCs中pSrc和pAKT蛋白的表达。结果:Nanog和Sox2蛋白在CD133^+表型OCSCs中的表达显著高于CD133-表型OCSCs中的表达;miR-218在CD133^+表型OCSCs中的表达显著低于CD133-表型OCSCs中的表达(P18mimic组OCSCs增殖减慢,OCSCs肿瘤球形成能力下降。OCSCs_(miR-218)裸鼠成瘤体积显著低于OCSCsvector组(Ppag1为miR-218的靶基因,miR-218 mimic组pag1 mRNA的表达减少。Western印迹法检测miR-218 mimic组OCSCs中pSrc和pAKT蛋白的表达显著减少。结论:MiR-218在OCSCs中低表达,可能通过靶向下调pag1,抑制pSrc和pAKT蛋白的表达影响OCSCs的干性。

关键词：卵巢癌 miRNA-218 pag1 干性

陆地棉纤维发育相关基因GhEXPA8的克隆与功能分析

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陆地棉纤维发育相关基因GhEXPA8的克隆与功能分析

作者：王瑞河南农业大学

学位级别：硕士

棉花是世界上重要的经济作物之一,棉纤维是纺织工业的重要原料。目前,陆地棉是最主要的栽培品种之一,其棉纤维产量高,但纤维品质有待改良。提高纤维品质是棉花的主要育种目标,因此,对陆地棉纤维发育相关基因的挖掘及调控机制的探究具有... 详细信息

棉花是世界上重要的经济作物之一,棉纤维是纺织工业的重要原料。目前,陆地棉是最主要的栽培品种之一,其棉纤维产量高,但纤维品质有待改良。提高纤维品质是棉花的主要育种目标,因此,对陆地棉纤维发育相关基因的挖掘及调控机制的探究具有重要意义。棉纤维由胚珠外表皮细胞发育而来,是最长的植物细胞之一。扩张蛋白是一类参与细胞扩大、细胞壁修饰过程的细胞壁蛋白,几乎参与植物的整个发育进程。扩张蛋白在棉纤维细胞发育中的作用仍不清楚。前期研究通过分析棉花纤维短缩突变体pag1的转录组数据,发现扩张蛋白基因GhEXPA8的表达量在纤维伸长期显著下调。为探讨扩张蛋白在棉纤维细胞发育中的作用机制,本论文开展了陆地棉纤维发育相关基因GhEXPA8的克隆与功能分析研究,结果如下:***8基因的克隆和生物信息学分析根据中国农科院棉花研究所发布的陆地棉基因组中的核苷酸序列(CotAD9957,Expansin2),从陆地棉中克隆了该基因cDNA编码框全长并将其命名为GhEXPA8。生物信息学分析显示GhEXPA8基因的CDS长762bp,编码253个氨基酸,1-25个氨基酸为信号肽,含有DPBB与pollenllerg两个结构域。信号肽和两个保守的结构域都是α扩张蛋白的典型特征。进化树分析进一步表明该基因编码的蛋白隶属于扩张蛋白α亚家族。***8基因的功能分析荧光定量PCR实验检测GhEXPA8在棉花的不同组织及纤维的不同发育阶段的相对表达量,结果显示GhEXPA8在根、茎、叶、胚珠中表达量较低,在纤维发育过程中呈先上升后下降的趋势,在开花后10天的纤维中表达量最高,在开花后15天的纤维中表达量趋于下降。GhEXPA8启动子驱动GUS基因在拟南芥中表达发现GUS染色出现在转基因植株的各个器官,尤其在根毛、根尖、茎尖较等幼嫩部位。维管组织例如叶脉、叶柄等部位GUS信号也很明显。拟南芥的毛状体发育和棉纤维发育机制类似,GhEXPA8启动子GUS活性在拟南芥根毛处检测到,暗示该基因在棉花中可能与纤维发育有关。GhEXPA8在棉花和转基因拟南芥中的表达模式说明它可能在棉花纤维伸长过程中发挥作用。通过GhEXPA8基因在拟南芥中过表达分析发现拟南芥幼苗根明显变长。这表明GhEXPA8是一个有功能的α扩张蛋白,也暗示了GhEXPA8可能在棉纤维发育中发挥调控作用。另外,上述组织表达模式分析也暗示该基因可能在纤维伸长过程中起作用。综合起来,推测GhEXPA8可能参与纤维发育调控过程。3.以中棉所24下胚轴作为外植体材料,利用根癌农杆菌介导的棉花遗传转化方法获得GhEXPA8转基因棉花T0代转化体24个,为深入解析GhEXPA8基因的功能打下了基础。

关键词：棉花 GhEXPA8 α扩张蛋白纤维伸长表达模式 pag1