PAG1棕榈酰化位点突变与皮肤鳞状细胞癌的相关性研究
作者单位:青岛大学
学位级别:硕士
导师姓名:王静
授予年度:2019年
学科分类:1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要:目的:本研究旨在探讨富含鞘磷脂的脂膜微区结合酪氨酸磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains,PAG),人源性称为PAG1。棕榈酰化位点突变(即C-X-X-C突变为A-X-X-A)对皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)A431细胞系生物学行为的影响,并进一步研究棕榈酰化位点突变的PAG1与Src信号传递中相关调控分子的相关性及其分子机制。方法:通过Uniprot蛋白数据库查询PAG1分子结构,选择将PAG1棕榈酰化位点中的半胱氨酸突变为丙氨酸,选用A431细胞系为研究对象,用携带增强绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的过表达野生型PAG1和棕榈酰化位点突变的PAG1以及仅含有增强绿色荧光的慢病毒载体转染A431细胞,建立了稳定过表达野生型PAG1的A431细胞株(WT-PAG1组)、过表达PAG1棕榈酰化位点突变的A431细胞株(mutant-PAG1组)以及只带有绿色荧光的阴性对照组(control组)和未经处理的空白对照组(parental组)。用激光共聚焦显微镜检测经慢病毒转染后WT-PAG1组、mutant-PAG1组以及control组细胞中绿色荧光的表达情况;用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测扩大培养后细胞转染率,用分选FCM分选3组细胞中携带绿色荧光的细胞,并采用有限稀释法筛选获得单克隆目的细胞系并扩大培养。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)法检测细胞内Pag1 mRNA的表达水平;蛋白印迹法(Western blot)检测细胞内PAG1蛋白的表达水平;用细胞增殖实验CCK8法检测A431细胞的增殖能力;Annexin V-APC/PI双染法检测棕榈酰化位点突变对A431细胞凋亡的影响;划痕实验和Transwell迁移检测A431细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验检测A431细胞的侵袭能力。Western Blot检测与PAG1结合的抑制性酪氨酸激酶Csk以及Src活化信号通路中重要的信号分子Fyn的表达水平。结果:(1)在经慢病毒转染96h后,用激光共聚焦显微镜观察WT-APG1、mutant-PAG1以及control组绿色荧光几乎遍布整个视野;FCM检测经慢病毒转染后,3组细胞携带荧光的阳性率,结果显示control组,WT-PAG1组以及mutant-PAG1组的荧光阳性率分别为86.2%、88.1%及87.8%,随后用RT-PCR检测细胞中Pag1基因mRNA的表达水平,结果显示,WT-PAG1组和mutant-PAG1组中Pag1基因mRNA的表达量分别为parental组的1.65和1.68倍,差异具有统计学意义(P0.05),说明PAG1能明显抑制A431细胞系的增殖,而棕榈酰化位点突变的PAG1丧失了抑制细胞增殖的能力。(3)细胞凋亡结果显示,parental组和control组的凋亡率分别为5.30%±0.04%和4.20%±0.06%,WT-PAG1的A431细胞凋亡明显增加,凋亡率为11.20%±0.04%,与parental和control组相比差异具有统计学意义(P0.05)。(4)划痕修复实验结果显示,与parental组和control组相比,WT-PAG1组细胞愈合能力明显降低(P0.05);Tranwell迁移实验结果表明,WT-PAG1组细胞的迁移能力与parental和control组相比明显降低。与WT-PAG1组相比,mutant-PA