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羊口疮病毒B2L基因和绵羊痘病毒p32基因DNA重组疫苗的构建

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羊口疮病毒B2L基因和绵羊痘病毒P32基因DNA重组疫苗的构建

作者：文美龄吉林大学

学位级别：硕士

羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)为痘病毒科(poxviridae)副痘病毒属(parapoxvirus)的代表成员,具有高度的嗜上皮性,是引起绵羊、山羊等动物“口疮”的重要病原,临床上以在感染动物的口、唇等部位皮肤/黏膜出现丘疹、红斑、水疱、脓疱及痂皮... 详细信息

羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)为痘病毒科(poxviridae)副痘病毒属(parapoxvirus)的代表成员,具有高度的嗜上皮性,是引起绵羊、山羊等动物“口疮”的重要病原,临床上以在感染动物的口、唇等部位皮肤/黏膜出现丘疹、红斑、水疱、脓疱及痂皮为主要特征。该病传染性强,可通过直接和间接接触发生感染,羔羊最为易感,严重影响羔羊的生长性能。绵羊痘病毒(Sheep pox virus,SppV)为痘病毒科(poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员,其引发的绵羊痘(Sheep pox,Sp)是一种急性、热性、高度接触性传染病,主要以在全身部位的皮肤/黏膜形成典型的结节性病变为特征,传染性强,且致死率高。目前,羊口疮和绵羊痘已成为羊群中常见病毒性疾病,严重制约养羊业的发展。鉴于羊口疮和绵羊痘对养羊业的危害较为突出,且目前尚缺乏安全、效果确实的疫苗用于上述两种疾病的防治,因此,本研究开展了针对ORFV、SppV主要免疫原基因串联DNA疫苗的研究。首先以具有良好免疫原性的ORFV B2L和SppV p32基因作为候选抗原基因,通过重叠延伸pCR技术,使用自剪切肽p2A的DNA片段将B2L基因和p32基因进行串联,再利用无缝克隆技术克隆至真核表达载体。之后将表达B2L-p2A-p32的重组质粒转染至真核细胞,转染后48 h进行Western Blot分析。结果表明,翻译后的多肽在p2A处发生了自剪切,使得B2L及p32两种蛋白在真核细胞内能够独立表达。为明确pc DNA3.1-B2L-p2A-p32重组疫苗质粒的免疫保护效果及作为疫苗候选株的应用前景,本研究将制备的重组DNA疫苗质粒与佐剂混合后免疫Balb/c小鼠,免疫程序为第0 d首免,第21 d加强免疫,在二免后14 d进行攻毒保护试验。对血清特异性抗体、中和抗体、免疫球蛋白Ig G1和Ig G2a水平的检测结果显示,pc DNA3.1-B2L-p2A-p32重组疫苗质粒联合佐剂免疫能够诱导抗ORFV和SppV的特异性抗体,以及抗SppV中和抗体的产生。利用ELISA方法对血清中细胞因子进行检测,结果显示,pc DNA3.1-B2L-p2A-p32重组疫苗质粒联合佐剂免疫组能够诱导较高水平的IFN-γ和IL-4,统计学差异显著。上述结果表明,pc DNA3.1-B2L-p2A-p32重组疫苗质粒与佐剂混合免疫能有效诱导机体的免疫应答反应。动物攻毒保护性试验结果显示,pc DNA3.1-B2L-p2A-p32重组疫苗质粒联合佐剂免疫组能有效降低小鼠肺脏中的病毒载量,该结果表明重组疫苗质粒能够提供良好的免疫保护。综上,ORFV B2L和SppV p32基因串联表达的重组疫苗质粒有望用于DNA疫苗的制备,为临床上针对羊口疮和绵羊痘的防控提供重要的技术手段。

关键词：羊口疮病毒绵羊痘病毒 B2L基因 p32基因重组DNA疫苗

羊痘病毒p32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

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病毒学报 2008年第2期24卷 133-137页

作者：陈轶霞才学鹏景志忠丁军涛王颖蒙学莲张燕贾万忠乔军闫鸿斌房永祥陈国华骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

通过pCR方法扩增全长p32基因和截去跨膜区的p32基因(Mp32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-p32、pcDNA3·1-CpG-p32和pcDNA3·1-CpG-Mp32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞亚群。结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达p32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞数目和CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组。结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答。

关键词：羊痘病毒 p32基因真核表达载体表达免疫原性

山羊痘病毒p32抗原基因口服活载体DNA疫苗的构建

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中国兽医科学 2017年第3期47卷 269-278页

作者：丁军涛王颖张雪彬吴金恩郑亚东孔贺磊张贝贝新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

以减毒鼠伤寒沙门菌X 4550为载体,构建编码缺失跨膜区和疏水区的山羊痘病毒p32基因的新型口服活载体D N A疫苗,通过体外传代培养、大剂量接种试验、免疫组织化学试验、ELISA等对其安全性、稳定性、免疫原性及免疫效果等进行综合检测评... 详细信息

以减毒鼠伤寒沙门菌X 4550为载体,构建编码缺失跨膜区和疏水区的山羊痘病毒p32基因的新型口服活载体D N A疫苗,通过体外传代培养、大剂量接种试验、免疫组织化学试验、ELISA等对其安全性、稳定性、免疫原性及免疫效果等进行综合检测评价。结果表明,X4550/pVAX1-p32在体外可稳定传代100代以上,小鼠口服1×10^(10)CF U X4550/pVAX1-p32后存活率为100%,接种后第10天仍能从脾中分离到X4550/pVAX1-p32,表明X4550/pVAX1-p32在体内外均具有良好的安全性和稳定性。免疫组织化学试验结果显示免疫小鼠脾细胞内有黄褐色粗颗粒,表明X4550能将pVAX1-p32有效递呈至免疫效应细胞并在其内表达具有生物活性的p32蛋白。ELISA结果显示,X4550/pVAX1-p32免疫组的抗体水平显著高于pVAX1-p32免疫组(0.01ppVAX1-p32免疫组能诱导持续时间更长的抗体水平(ppVAX1-p32具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生持久的、高水平的免疫应答,这为羊痘新型疫苗的研究和应用奠定了基础。

关键词：山羊痘病毒 p32基因 X4550/pVAX1-p32 免疫效果

山羊痘病毒p32基因的原核表达及生物信息分析

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生物技术 2012年第4期22卷 32-37页

作者：蒲德治龚晨燕刘永蒋高建于峰江苏大学食品科学与生物工程学院江苏镇江212013 江苏大学生命科学学院江苏镇江212013

目的:构建表达山羊痘(GpV)p32蛋白的原核表达载体pTYB11-gpvp32,初步分析其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的较佳表达条件。方法:首先用序列分析软件Blastp、MEGA5.1、SOSUI等对GpVp32进行生物信息学分析;primer primier5.0软件设计引物,在... 详细信息

目的:构建表达山羊痘(GpV)p32蛋白的原核表达载体pTYB11-gpvp32,初步分析其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的较佳表达条件。方法:首先用序列分析软件Blastp、MEGA5.1、SOSUI等对GpVp32进行生物信息学分析;primer primier5.0软件设计引物,在上游引物添加限制性酶切位点SpeⅠ、下游引物添加限制性酶切位点XhoⅠ,以pSK-gpvp32为模板,pCR扩增方法获得基因片段,克隆入pMD18-Simple-T,构建pMD18SimpleT-gpvp32载体,转化大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞,经酶切筛选、测序确定插入序列的正确,然后将gpvp32克隆入原核表达载体pTYB11中的SpeⅠ、XhoⅠ酶切位点,构建原核表达质粒pTYB11-gpvp32;转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,IpTG诱导重组蛋白表达,SDS-pAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白在不同诱导时间下的表达情况。结果:成功构建山羊痘病毒原核表达载体pTYB11-gpvp32并在大肠杆菌(E.coli)BL21中成功表达GpVp32,经检测重组蛋白表达量约为菌体总蛋白的28%,进化树结果表明山羊痘的亲缘关系与地理位置存在差异及在不同的羊群中进化的结果,经SOSUI等软件综合分析知GpVp32是山羊痘病毒跨膜蛋白的囊膜蛋白但不是信号肽。结论:山羊痘病毒p32基因在大肠杆菌中获得高效表达,为山羊痘病毒的流行性调查、分子生物学研究以及以后有效防治本病提供了物质基础。

关键词：山羊痘病毒 p32基因原核表达

绵羊痘病毒吉林株的分离鉴定及其RpO30、p32和Kl基因的克隆与进化分析

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中国兽医学报 2018年第10期38卷 1852-1857页

作者：田静关继羽周艳龙钟嘉伟周帅帅徐梦实魏新宇高丰赵魁吉林大学动物医学学院

从病理学和病原学角度对临床一起疑似羊痘病例进行了系统的检测分析,确诊该起病例为绵羊痘病毒（sheep poxvirus,SppV）感染所致。对病死羊进行大体病理剖检,病羊口腔黏膜、尾根及肺脏等内脏器官表面可见有大量痘疹样结节;病理组织学观... 详细信息

从病理学和病原学角度对临床一起疑似羊痘病例进行了系统的检测分析,确诊该起病例为绵羊痘病毒（sheep poxvirus,SppV）感染所致。对病死羊进行大体病理剖检,病羊口腔黏膜、尾根及肺脏等内脏器官表面可见有大量痘疹样结节;病理组织学观察可见,肺脏支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞发生变性、坏死、脱落,并伴有上皮化生;此外,在肺泡上皮细胞胞浆中可见有嗜酸性病毒包涵体,该结果提示这起病例可能是羊痘病毒感染所致。之后从病原学角度进行了检测分析,电镜负染观察可见典型的痘病毒粒子;RpO30、p32、Kl基因的pCR检测结果显示,均扩增出与预期目的片段大小相一致的条带;p32基因的系统发育进化分析结果显示,该分离株与SppV-AV40的亲缘关系较近,证实了该起病例的病因为SppV感染所致,命名为SppV-Jilin分离株（KF991006）。该分离株RpO30和Kl基因的测序分析结果发现,与山羊痘病毒相应序列相比,其RpO30基因缺少21bp的核酸序列,而Kl基因在902～925bp位置处存在缺失,该结果表明RpO30和Kl基因将可能用于绵羊痘病毒与山羊痘病毒的鉴别诊断。

关键词： SppV 分离鉴定 RpO30基因 p32基因 Kl基因序列分析

山羊痘病毒p32基因与绵羊CD58基因共表达载体的构建及其免疫活性分析

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中国兽医科学 2015年第3期45卷 298-303页

作者：芦晓立吴国华颜新敏张强商洛学院生物医药与食品工程学院陕西商洛726000 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

为了增强山羊痘病毒p32蛋白的免疫效果,发挥CD58的免疫佐剂作用,将山羊痘病毒p32基因和绵羊CD58基因构建在同一载体上,转染BHK21细胞,通过直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验分别间接检测p32和直接检测CD58在BHK21中的表达。结果显示,... 详细信息

为了增强山羊痘病毒p32蛋白的免疫效果,发挥CD58的免疫佐剂作用,将山羊痘病毒p32基因和绵羊CD58基因构建在同一载体上,转染BHK21细胞,通过直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验分别间接检测p32和直接检测CD58在BHK21中的表达。结果显示,p32和CD58在BHK21细胞中都有表达。以构建的p32基因与绵羊CD58基因共表达载体为DNA疫苗,通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,定期采血,用ELISA检测免疫抗体水平,用MTT法检测细胞免疫情况;结果表明,共表达载体可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。

关键词：山羊痘病毒 p32基因 CD58基因共表达载体体液免疫细胞免疫

山羊痘病毒p32基因的克隆、测序及在原核细胞表达

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江苏农业科学 2008年第4期36卷 57-60页

作者：程振涛岳筠徐春志李永明许乐仁文明周碧君贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

为比较山羊痘病毒贵州分离株p32基因与国内外分离株的关系,并获得p32蛋白,应用pCR方法从贵州山羊痘病毒分离株的核酸样本中扩增出p32基因片段,将pCR产物克隆至pMD18-T载体,对重组质粒进行了基因序列测定。将测定的p32基因核苷酸序列和... 详细信息

为比较山羊痘病毒贵州分离株p32基因与国内外分离株的关系,并获得p32蛋白,应用pCR方法从贵州山羊痘病毒分离株的核酸样本中扩增出p32基因片段,将pCR产物克隆至pMD18-T载体,对重组质粒进行了基因序列测定。将测定的p32基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中相应序列作比较,同源性分别达到99.4%和98.4%,表明山羊痘病毒的p32基因具有高度保守性。将p32基因克隆至原核表达载体pET-28a,成功构建重组表达质粒pET-28a-p32/LD,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-pAGE检测显示,重组细菌在35.5 kDa处表达一条特异性的蛋白带,而阴性对照未见这条蛋白带;Western-Blotting检测证实,这条蛋白带能与山羊痘高免血清反应而显示其免疫学活性。

关键词：山羊痘病毒 p32基因基因克隆序列分析原核表达

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羊痘病毒p32基因生物信息学分析

西北农业学报 2011年第8期20卷 20-24页

作者：程振涛岳筠周碧君许乐仁王开功文明李永明贵州大学动物疫病研究所贵阳550025 贵州省动物疫病研究室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025

为获得羊痘病毒p32基因生物信息学资料,扩增山羊痘病毒贵州LD株的p32基因,并进行克隆、测序与序列分析;以p32基因的推导氨基酸序列为材料,应用计算机技术和生物学软件预测p32蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二... 详细信息

为获得羊痘病毒p32基因生物信息学资料,扩增山羊痘病毒贵州LD株的p32基因,并进行克隆、测序与序列分析;以p32基因的推导氨基酸序列为材料,应用计算机技术和生物学软件预测p32蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构,综合评价p32蛋白的抗原表位。结果表明,羊痘病毒p32基因核苷酸和氨基酸同源性分别达到97.8%和95.6%以上;p32蛋白为含有一个跨膜结构的膜蛋白;肽段227-251区域的各种预测指数均高,推断该区域为一个潜在的优势抗原表位。数据分析显示,p32蛋白具有较强的抗原性,该结果将为GpV p32基因工程疫苗的研究和体外表达产物的应用提供依据。

关键词：羊痘病毒 p32基因生物信息学

山羊痘病毒p32基因真核表达载体的构建及表达

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中国兽医学报 2009年第8期29卷 982-985页

作者：谢芳张强颜新敏吴国华李健朱海霞郭爱疆韩若婵施程洪鞠厚斌朱彩珠岳城才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐830052

从重组克隆载体pMD18-p32中扩增出山羊痘病毒p32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体ppIC9K相连接,构建重组表达载体ppIC9K-p32。重组质粒ppIC9K-p32用SalⅠ线性化后,与毕赤酵母(pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染... 详细信息

从重组克隆载体pMD18-p32中扩增出山羊痘病毒p32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体ppIC9K相连接,构建重组表达载体ppIC9K-p32。重组质粒ppIC9K-p32用SalⅠ线性化后,与毕赤酵母(pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达。SDS-pAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别。

关键词：山羊痘病毒 p32基因毕赤酵母诱导表达