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钙库操纵型钙通道orai3分子对冠状动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

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昆明医科大学学报 2023年第4期44卷 16-22页

作者：王惠曾文珺张海萍郭瑞威解放军联勤保障部队第920医院心血管内科云南昆明650032

目的探讨钙库操纵型钙通道orai3对冠状动脉血管平滑肌细胞(CASMC)增殖的影响。方法培养原代冠状动脉血管平滑肌细胞(coronary vascular smooth muscle cells,CASMC),对CASMC中orai3分子实施干扰和过表达干预,QPCR实验和Western Blot检测... 详细信息

目的探讨钙库操纵型钙通道orai3对冠状动脉血管平滑肌细胞(CASMC)增殖的影响。方法培养原代冠状动脉血管平滑肌细胞(coronary vascular smooth muscle cells,CASMC),对CASMC中orai3分子实施干扰和过表达干预,QPCR实验和Western Blot检测orai3表达量,CCK8实验和细胞计数检测CASMC增殖情况。结果CCK8实验和细胞计数实验显示无血清组较10%血清组CASMC增殖速率下降(Porai3表达量下降(Porai3后与对照组相比CASMC增殖速率下降(Porai3后与对照组相比细胞增殖速率升高(Porai3在CASMC增殖中发挥重要作用。

关键词：冠状动脉血管平滑肌细胞细胞增殖 orai3 钙库操纵型钙通道

orai3介导的钙库操纵性钙内流对继发性甲状旁腺功能亢进患者甲状旁腺激素释放的影响

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Orai3介导的钙库操纵性钙内流对继发性甲状旁腺功能亢进患者甲状...

作者：林章莹安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:继发性甲状旁腺功能亢进症（SHPT）是慢性肾脏病的常见并发症,主要表现为甲状旁腺激素（PTH）分泌过多和低钙血症。磷酸盐积累,FGF23水平的升高,活性维生素D产生的减少,以及低钙血症,PTH分泌增加是甲状旁腺增生的持续刺激因素。在... 详细信息

背景:继发性甲状旁腺功能亢进症（SHPT）是慢性肾脏病的常见并发症,主要表现为甲状旁腺激素（PTH）分泌过多和低钙血症。磷酸盐积累,FGF23水平的升高,活性维生素D产生的减少,以及低钙血症,PTH分泌增加是甲状旁腺增生的持续刺激因素。在慢性肾脏病中晚期,1,25（OH）D3水平降低和PTH分泌过多,增加了心血管事件的发生和死亡率的增加。继发性甲旁亢症的机制复杂。甲状旁腺与钙互相影响,1,25（OH）D3缺乏间接引起PTH合成增多。PTH可作用于骨、肾及肠道,来介导血清钙的升高;然而PTH还增加了FGF23的产生,从而增强了磷尿,减少了肾中维生素D的产生。orai3是Ca2+通道蛋白orai家族的一员,由于其在介导钙库操纵的钙内流（store-operated calcium entry,SOCE）中的作用而受到广泛关注。orai家族最早被认为是SOC或称钙释放激活钙离子通道（Ca2+release-activated Ca2+channel,CRAC）的构成蛋白,是4次跨膜蛋白,包括orai1、orai2和orai3一种选择性钙通道,在肿瘤的发病、心血管疾病以及免疫疾病中发挥重要作用,而orai3在继发性甲旁亢症中的作用尚不明确。目的:（1）观察甲状旁腺细胞中,orai3是否介导钙库操纵性钙内流（2）观察orai3对PTH合成和分泌的影响方法:（1）转录组测序（RNA-seq）对获得的对照组和实验组的甲状旁腺用高通量测序进行测序分析,反映出其RNA的表达水平。（2）蛋白免疫印迹用于检测SHPT患者甲状旁腺中orai3的蛋白水平;用lip3000将特异性orai3si RNA转染进入原代甲状旁腺细胞中后,检测orai3 si RNA对orai3蛋白的敲低效率。（3）钙成像用于检测orai3通道对甲状旁腺细胞中钙信号的影响,以及用orai3 si RNA敲低orai3蛋白水平后钙信号的变化。（4）酶联免疫吸附实验人甲状旁腺激素相关蛋白（PTHr P）酶联免疫吸附测定试剂盒按双抗体夹心ELISA法检测PTH水平。（5）orai3敲除鼠检测orai3基因敲除大鼠血清PTH水平来验证orai3表达减少对PTH水平的影响。结果:（1）从转录组测序及数据分析及western blot结果来看,SHPT患者的甲状旁腺细胞orai3的表达明显高于对照组。（2）甲状旁腺细胞中,转染特异性小干扰RNA敲低orai3,orai3蛋白表达水平显著被抑制,钙库操纵性钙内流被显著抑制,（3）甲状旁腺细胞中,转染特异性小干扰RNA敲低orai3,PTH释放明显减少。（4）orai3敲除鼠血液中的PTH水平显著降低。结论:SHPT的甲状旁腺中,orai3的表达水平升高。orai3介导甲状旁腺细胞中的钙库操纵性钙内流且影响PTH的分泌。orai3表达水平及其介导的钙信号是甲状旁腺激素释放的潜在机制,orai3在继发性甲旁亢症的发生发展中可能发挥着重要作用。

关键词：继发性甲状旁腺功能亢进症 orai3 钙信号甲状旁腺激素

orai3在X射线照射后大鼠脑微血管内皮细胞中的改变及其对细胞增殖、迁移、成管及凋亡的影响

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Orai3在X射线照射后大鼠脑微血管内皮细胞中的改变及其对细胞增殖...

作者：张新晨安徽医科大学

学位级别：硕士

背景放射性脑水肿是头颈部肿瘤放疗后的常见并发症,其发病率随着放疗在临床广泛应用而逐年增高,且预后普遍较差,严重影响患者生存质量。放射性脑水肿的发病机制目前仍不明晰,近年来有大量研究表明,脑微血管内皮细胞对放射线高敏感,其构... 详细信息

背景放射性脑水肿是头颈部肿瘤放疗后的常见并发症,其发病率随着放疗在临床广泛应用而逐年增高,且预后普遍较差,严重影响患者生存质量。放射性脑水肿的发病机制目前仍不明晰,近年来有大量研究表明,脑微血管内皮细胞对放射线高敏感,其构成的脑微血管在放射后发生损伤是导致放射性脑水肿形成的重要因素之一。因此,寻找减轻放射引起的脑微血管内皮细胞损伤的方法,对于临床预防和治疗放射性脑水肿有重要价值。有文献报道,放射线能够引起细胞内钙库操纵的钙内流(store operated Caentry,SOCE)明显增强,使细胞内发生“钙超载”导致细胞损伤。orai3作为构成SOCE的重要钙通道蛋白之一,其可通过介导SOCE引起Ca内流,影响脑微血管内皮细胞多种重要病理生理反应。本文旨在探究orai3在X射线照射后的改变及对大鼠脑微血管内皮细胞功能的影响,有助于阐明放射性脑水肿发生机制,为临床预防和治疗放射性脑水肿提供新的潜在靶点。目的1.观察X线照射后orai3表达情况;2.探究orai3对X射线照射后大鼠脑微血管内皮细胞增殖、迁移、成管和凋亡的影响及机制;3.观察orai3敲除大鼠和野生型大鼠在X线照射后脑组织病理变化。方法1.培养脑微血管内皮细胞取200g±20g的SD大鼠,CO窒息处死,剥离硬脑膜和软脑膜,收集大脑皮质置于皿中,用眼科剪充分剪碎为组织碎渣,然后通过80目和200目筛网对剪碎的混合物进行过滤,加入II型胶原酶消化30min,消化下来的细胞培养24h后换液,继续培养以用于后续实验。2.X射线照射细胞生长融合达70%时,接受X射线照射,剂量为20Gy,对照组采用“假照射”,即不接受X射线照射,其他处理过程同照射组。3.q PCR和Western Blot实验观察照射后orai3表达将从野生型大鼠中提取的BMEC分为2组,分别是:对照组、X射线照射组,在24h、48h进行q PCR和Western Blot实验观察orai3表达情况。4.细胞划痕实验检测迁移能力野生型大鼠基因型为orai3(+/+),orai3基因敲除大鼠的基因型为orai3(-/-)。使用钙通道抑制剂BTP2抑制orai3。将实验分为5组:即orai3(+/+)+0Gy;orai3(+/+)+20Gy;orai3(+/+)+20Gy+BTP2,照射前给与10μMBTP2处理;orai3(-/-)+20Gy;orai3(-/-)+20Gy+BTP2,照射前给与10μM BTP2处理。采用划痕实验观察各组细胞迁移能力。5.CCK8法检测细胞增殖能力分组同上,使用CCK-8试剂检测各组细胞增殖能力。6.Matrigel基质胶检测细胞成管能力分组同上,使用Matrigel基质胶检测各组细胞成管能力。7.TUNEL试剂盒及Western Blot检测细胞凋亡分组同上,使用TUNEL法检测各组细胞的凋亡以及采用Western Blot实验检测凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3及凋亡拮抗蛋白Bcl-2的表达。8.动物脑组织切片HE染色动物实验分为3组,实验组为野生型SD大鼠和orai3敲除大鼠麻醉后行全脑X线照射20Gy,对照组为野生型SD大鼠进行假照射(同样条件下麻醉,不接受X射线照射)。接受X线辐照后24h,制作大鼠脑组织病理切片并通过HE染色观察病理变化。9.钙成像分组同划痕实验,观察X线对各组细胞钙内流的影响。结果1.q PCR及Western Blot显示X线照射后orai3表达水平显著增高。2.划痕实验显示,X线对BMEC迁移有抑制作用,抑制和敲除orai3能降低这种迁移抑制作用。3.CCK8实验显示,X线对BMEC增殖起到抑制,抑制和敲除orai3能降低这种增殖抑制作用。4.成管实验中,X线对BMEC成管有抑制作用,抑制和敲除orai3能降低这种成管抑制作用。5.Tunel实验显示,X线能诱导BMEC发生凋亡,抑制和敲除orai3能降低X线诱导的细胞凋亡。6.Western Blot实验中,X线能引起细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3表达上升,凋亡拮抗蛋白Bcl-2的表达下降,抑制和敲除orai3能降低X线诱导的Bax、Caspase-3表达,提高Bcl-2的表达。7.动物水平上,X射线照射后野生型大鼠脑组织HE染色下可见血管壁变薄,与周围组织间隙变大,胞核缩小等病理改变。orai3敲除大鼠X线照射后血管病理损伤程度较野生型大鼠减轻。8.X线照射后细胞钙内流较未照射组增强,抑制和敲除orai3能降低放射引起的钙内流。结论1.X射线照射后的脑微血管内皮细胞orai3高表达,orai3上调可能是导致放射性脑水肿的重要原因。2.抑制和敲除orai3可改善放射线处理后的大鼠脑微血管内皮迁移、增殖、成管能力并减轻放射诱导的细胞凋亡。3.X射线照射后在大鼠脑组织HE染色下可见血管病理性改变。敲除orai3能减轻X射线诱导的血管损伤。4.X射线照射后大鼠脑微血管内皮细

关键词：放射性脑水肿脑微血管内皮细胞 orai3

1,25二羟基维生素D3对人乳腺癌细胞orai1及orai3表达影响的实验研究

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1,25二羟基维生素D3对人乳腺癌细胞Orai1及Orai3表达影响的实验研...

作者：陈珊南华大学

学位级别：硕士

【目的】运用适当浓度1,25-二羟基维生素D3(1,25-dihydroxy vitamin D3,1,25-(OH)2D3)、他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)分别处理雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)不同表达状态的乳腺癌细胞系MCF-7(ER+,VDR+)、MDA-MB-231(ER-,VDR-)、MDA-MB-453(ER-,VDR+),检测三种细胞膜钙离子通道成分orai1,orai3表达变化,分析维生素D对乳腺癌细胞orai1及orai3表达的影响,探讨由维生素D诱导的对orai介导的Ca2+信号通路与ER受体通路的关联性,活性维生素D对ER受体及VDR受体不同表达状态下的乳腺癌细胞促进凋亡的作用及可能的机制。【方法】传代培养ER、VDR不同表达状态的乳腺癌细胞系MCF-7(ER+,VDR+),MDA-MB-231(ER-,VDR-),MDA-MB-453(ER-,VDR+),以1,25-(OH)2D3(1×10-8mol/L)处理对数生长期的乳腺癌细胞,同时用17-β-雌二醇(1×10-9mol/L)和他莫昔芬(1×10-6mol/L)分别处理这三种细胞作为对照,于处理后48h时间点收集细胞,提取RNA及蛋白,采用Real-time RT-PCR法检测orai1和orai3的mRNA相对含量,Western Blot检测其蛋白的表达情况。【结果】1.ER阳性表达的MCF-7乳腺癌细胞中orai3的表达水平高于ER阴性表达的MDA-MB-231,MDA-MB-453细胞(Porai3的表达,其ER受体拮抗剂TAM则抑制orai3的表达(Porai3的表达仅在ER及VDR阳性表达的MCF-7细胞中明显受到抑制(P31,ER阴性及VDR阳性MDA-MB-453细胞中未见明显受抑(P>0.05)。3.维生素D在VDR阴性表达的MDA-MB-231细胞中对orai1而非orai3表达有上调作用(P3(ER-,VDR+)细胞中未见对orai1表达的促进或抑制(P>0.05)。【结论】1.orai3在ER阳性表达的MCF-7乳腺癌细胞中呈现高表达,并可能受到雌激素受体作用通路的调控。2.通过维生素D所诱导的对MCF-7乳腺癌细胞orai3的表达改变提示维生素D在MCF-7乳腺癌细胞中对orai3的作用通路上可能间接与雌激素信号通路可能存在交叉作用。3.在MDA-MB-231细胞中,维生素D可能通过除VDR和ER信号通路外的机制影响orai1介导的Ca2+信号通路及其下游依赖Ca2+的靶点。

关键词：乳腺癌细胞骨化三醇维生素D受体 orai1 orai3

免疫炎性标志物对食管鳞状细胞癌新辅助治疗效果的预测价值研究

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免疫炎性标志物对食管鳞状细胞癌新辅助治疗效果的预测价值研究

作者：熊凯中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

第一部分NLR对食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者术前新辅助治疗效果的预测价值研究背景:ESCC是我国高发的消化道恶性肿瘤,目前临床上治疗ESCC的方法主要包括手术治疗和放化疗等。术前新辅助治疗用于局部进... 详细信息

第一部分NLR对食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者术前新辅助治疗效果的预测价值研究背景:ESCC是我国高发的消化道恶性肿瘤,目前临床上治疗ESCC的方法主要包括手术治疗和放化疗等。术前新辅助治疗用于局部进展期患者肿瘤降期,从而提高手术R0切除率。然而由于疾病分期、年龄、机体免疫状态、肿瘤异质性等因素,不同患者对新辅助治疗效果存在差异。因此,寻找预测ESCC新辅助治疗的生物标记物具有重要的临床意义。全身炎性反应为肿瘤细胞提供了合适的微环境,在肿瘤的进展、侵袭、转移等方面均发挥着重要作用。常见的免疫炎性反应指标如C反应蛋白(c-reactive protein,CRP)、降钙素原(procalcitonin,PCT)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等未推广常规检查,但中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio,NLR)、血小板-淋巴细胞比值(platelet lymphocyte ratio,PLR)、淋巴细胞-单核细胞比值(lymphocyte monocyte ratio,LMR)等可通过血常规获得,应用十分普遍且简便可行。研究目的:探究NLR、PLR、LMR对ESCC患者术前新辅助治疗效果的预测价值。研究方法:选择陆军军医大学大坪医院肿瘤中心2016年1月至2020年6月行术前新辅助治疗的ESCC患者104例,收集患者新辅助治疗前第3天的血常规检验结果,主要包括:中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、血小板计数,并计算NLR、PLR、LMR的值。利用新辅助治疗前后碘水造影、胸部增强CT记录病灶大小变化。对患者进行每3个月1次电话随访,随访内容包括患者新辅助放化疗后病灶影像学复查结果以及总生存时间(overall survival,OS)。采用Mann-Whitney U检验分析不同临床缓解情况NLR的差异,ROC曲线分析评估NLR对新辅助放化疗缓解的预测效能,根据Youden指数确定最佳截断值,χ检验分析新辅助治疗前NLR与临床特征的关系,Logistic回归分析新辅助放化疗效果的独立预测因素。Cox等比例风险模型分析OS的独立预后因素。不同临床特征亚组间OS采用Kaplan-Meier生存曲线分析。研究结果:新辅助治疗临床缓解达到CR、PR、SD和PD分别有0例,38例,54例,12例。104例患者失访7例,因ESCC死亡42例,因其他疾病(窒息、脑梗、肺部感染等)死亡4例。治疗前血液NLR是食管鳞癌新辅助放化疗临床缓解的独立预测因素(OR=0.404 95%CI:0.208～0.787,P=0.008),受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析显示NLR对新辅助放化疗后达到缓解有中等预测效能(AUC=0.737,95%CI:0.631～0.844,P3.7%。多因素Cox分析表明只有新辅助放化疗后行手术治疗(HR=0.258,95%CI:0.068～0.983,P=0.047)是OS独立预后因素。研究结论:新辅助治疗前ESCC患者血液NLR可能作为治疗后临床缓解情况的独立预测指标,但OS未显示出有统计学差异的预测价值;LMR和PLR对ESCC新辅助治疗效果无明显预测价值,所得结论需大样本量或多中心、前瞻性研究对研究结果进行证实。第二部分肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中M2型巨噬细胞潜在功能基因的筛选及验证研究背景:TME由免疫细胞及其亚型、基质细胞以及各类小分子等成分组成,是构成肿瘤异质性的重要组成部分,与肿瘤的发生、发展、转移有着密切的联系,且与肿瘤的治疗效果密切相关。M2型巨噬细胞是TME中巨噬细胞的一种亚型,可通过破坏基底膜、促进血管生成和免疫抑制等促进肿瘤进展、转移和侵袭。既往研究发现M2型巨噬细胞在肿瘤组织中浸润丰度越高,ESCC患者术前新辅助治疗效果越差,越难达到病理学缓解。但目前对于影响M2型巨噬细胞功能的潜在基因相关研究尚缺乏。研究目的:系统性筛选M2型巨噬细胞的潜在功能基因及验证。研究方法:从癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中获取ESCC患者标本中RNA表达谱数据集,病例数据共有79例,均为食管鳞癌R0切除标本,其中包含患者的疾病特异性生存期(Disease-specific survival,DSS)和OS数据。采用与肿瘤免疫失能和排斥(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion,TIDE)免疫评分构建相同的方法筛选M2型巨噬细胞的潜在功能基因:在TCGA数据库79例食管鳞癌并且R0切除患者中,以a×M

关键词： ESCC 新辅助治疗缓解情况 NLR TCGA数据库 GEO数据库 SOCS1 orai3

氧化型密度脂蛋白对晶状体囊膜上皮细胞的增殖能力及钙信号的影响机制

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氧化型密度脂蛋白对晶状体囊膜上皮细胞的增殖能力及钙信号的影响...

作者：张茹安徽医科大学

学位级别：硕士

背景血清中脂质的水平,尤其是氧化型低密度脂蛋白的水平与白内障的发生有关,但是氧化型低密度脂蛋白在白内障发展中的作用机制尚不清楚。已有众多文献支持晶状体内钙（Ca2+）超载与晶状体的混浊程度密切相关。钙库操控的钙内流（SOCE）... 详细信息

背景血清中脂质的水平,尤其是氧化型低密度脂蛋白的水平与白内障的发生有关,但是氧化型低密度脂蛋白在白内障发展中的作用机制尚不清楚。已有众多文献支持晶状体内钙（Ca2+）超载与晶状体的混浊程度密切相关。钙库操控的钙内流（SOCE）是介导晶状体囊膜上皮细胞Ca2+流入的重要途径。orai家族蛋白（形成SOCE通道）位于细胞膜上,以响应内质网中Ca2+库储存的耗尽,控制细胞外Ca2+的流入。在我们的研究中,我们在含有氧化型低密度脂蛋白的培养基中培养人的晶状体囊膜上皮细胞（HLEpiCs）以模拟体外高脂肪环境,探究氧化型低密度脂蛋白对HLEpiCs细胞的增殖和钙信号的影响机制。本研究为肥胖症或高脂血症合并白内障的发生机制提供新见解。目的1.探究氧化型低密度脂蛋白对HLEpiCs细胞增殖的影响机制;2.探究氧化型低密度脂蛋白对HLEpiCs细胞钙信号的影响机制。方法1.RNA的提取、测序和分析分别提取经过氧化型低密度脂蛋白和对照处理的HLEpiCs细胞的RNA,利用Illumina平台对RNA样本进行测序并获得原始数据。将通过质量检测的数据进行差异分析、聚类分析。2.免疫蛋白印迹实验Western Blot检测经过氧化型低密度脂蛋白和对照处理的HLEpiCs细胞orail、orai2和orai3蛋白表达水平。3.细胞增殖实验将不同处理因素的HLEpiCs细胞接种于96孔板（103-104个/每孔）,每孔100 μ L培养基,培养24h。然后每孔加入10μL CCK-8溶液,继续在培养箱内孵育2h左右。将细胞培养板放入酶标仪中,检测各组HLEpiCs细胞在450nm波长时的吸光值。4.Ca2+成像实验将不同处理因素的HLEpiCs细胞接种在盖玻片上,培养24h。然后加入荧光染料（Fluo-8）孵育 30min,分别加入三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）和氯化钙（CaCl2）检测Ca2+释放和钙库操控的钙内流。5.基因敲除鼠的鉴定首先从大鼠脚趾组织提取DNA,利用PCR扩增技术扩增大鼠DNA。根据琼脂糖凝胶电泳测定结果鉴定敲除鼠。6.统计学分析所有数据以平均数±标准误（mean ± S.E.M.）表示。两组之间的差异使用非配对的t检验（Student’s unpaired t test）分析,当P＜0.05时认为两组之间差异具有统计学的意义。结果（1）聚类分析结果显示,氧化型低密度脂蛋白增强了 HLEpiCs细胞orai3的表达,但未显著改变orail或orai2的表达。（2）氧化型低密度脂蛋白促进了 HLEpiCs细胞的增殖,并且呈浓度依赖性。（3）氧化型低密度脂蛋白显著增加HLEpiCs细胞ATP诱导的SOCE,但对Ca2+释放无显著影响。（4）免疫蛋白印迹实验结果显示,氧化型低密度脂蛋白增强了 HLEpiCs细胞orai3的表达,但未显著改变orail或orai2的表达。（5）orai3的下调显著降低了 HLEpiCs细胞的增殖能力和ATP诱导的SOCE。结论（1）氧化型低密度脂蛋白增强了 HLEpiCs细胞orai3的表达,但未显著改变orail或orai2的表达。（2）氧化型低密度脂蛋白促进了 HLEpiCs细胞的增殖,并且orai3 siRNA抑制了氧化型低密度脂蛋白引起的增殖增强。（3）氧化型低密度脂蛋白增加HLEpiCs细胞ATP诱导的SOCE,并且orai3 siRNA抑制了氧化型低密度脂蛋白引起的SOCE水平升高。

关键词：白内障氧化型低密度脂蛋白钙库操控钙内流 orai3 细胞增殖