Orai3介导的钙库操纵性钙内流对继发性甲状旁腺功能亢进患者甲状旁腺激素释放的影响

作     者：林章莹 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘业海

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：继发性甲状旁腺功能亢进症 Orai3 钙信号 甲状旁腺激素 

摘      要：背景:继发性甲状旁腺功能亢进症（SHPT）是慢性肾脏病的常见并发症,主要表现为甲状旁腺激素（PTH）分泌过多和低钙血症。磷酸盐积累,FGF23水平的升高,活性维生素D产生的减少,以及低钙血症,PTH分泌增加是甲状旁腺增生的持续刺激因素。在慢性肾脏病中晚期,1,25（OH）D3水平降低和PTH分泌过多,增加了心血管事件的发生和死亡率的增加。继发性甲旁亢症的机制复杂。甲状旁腺与钙互相影响,1,25（OH）D3缺乏间接引起PTH合成增多。PTH可作用于骨、肾及肠道,来介导血清钙的升高;然而PTH还增加了FGF23的产生,从而增强了磷尿,减少了肾中维生素D的产生。Orai3是Ca2+通道蛋白Orai家族的一员,由于其在介导钙库操纵的钙内流（store-operated calcium entry,SOCE）中的作用而受到广泛关注。Orai家族最早被认为是SOC或称钙释放激活钙离子通道（Ca2+release-activated Ca2+channel,CRAC）的构成蛋白,是4次跨膜蛋白,包括Orai1、Orai2和Orai3一种选择性钙通道,在肿瘤的发病、心血管疾病以及免疫疾病中发挥重要作用,而Orai3在继发性甲旁亢症中的作用尚不明确。目的:（1）观察甲状旁腺细胞中,Orai3是否介导钙库操纵性钙内流（2）观察Orai3对PTH合成和分泌的影响方法:（1）转录组测序（RNA-seq）对获得的对照组和实验组的甲状旁腺用高通量测序进行测序分析,反映出其RNA的表达水平。（2）蛋白免疫印迹用于检测SHPT患者甲状旁腺中Orai3的蛋白水平;用lip3000将特异性Orai3si RNA转染进入原代甲状旁腺细胞中后,检测Orai3 si RNA对Orai3蛋白的敲低效率。（3）钙成像用于检测Orai3通道对甲状旁腺细胞中钙信号的影响,以及用Orai3 si RNA敲低Orai3蛋白水平后钙信号的变化。（4）酶联免疫吸附实验人甲状旁腺激素相关蛋白（PTHr P）酶联免疫吸附测定试剂盒按双抗体夹心ELISA法检测PTH水平。（5）Orai3敲除鼠检测Orai3基因敲除大鼠血清PTH水平来验证Orai3表达减少对PTH水平的影响。结果:（1）从转录组测序及数据分析及western blot结果来看,SHPT患者的甲状旁腺细胞Orai3的表达明显高于对照组。（2）甲状旁腺细胞中,转染特异性小干扰RNA敲低Orai3,Orai3蛋白表达水平显著被抑制,钙库操纵性钙内流被显著抑制,（3）甲状旁腺细胞中,转染特异性小干扰RNA敲低Orai3,PTH释放明显减少。（4）Orai3敲除鼠血液中的PTH水平显著降低。结论:SHPT的甲状旁腺中,Orai3的表达水平升高。Orai3介导甲状旁腺细胞中的钙库操纵性钙内流且影响PTH的分泌。Orai3表达水平及其介导的钙信号是甲状旁腺激素释放的潜在机制,Orai3在继发性甲旁亢症的发生发展中可能发挥着重要作用。