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OTUD4调控ΔNP63α维持乳腺癌干性的机制研究

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OTUD4调控ΔNP63α维持乳腺癌干性的机制研究

作者：赵钰安徽理工大学

学位级别：硕士

目的:乳腺癌是女性中最常见的癌症,是女性癌症死亡的首要原因。乳腺癌干细胞是类似于成体干细胞特性的一类细胞,具有自我更新、多向分化以及体内成瘤的能力。P63是P53抑癌基因的同源物,它有两种主要的亚型:具有反式激活结构域的亚型(TAP... 详细信息

目的:乳腺癌是女性中最常见的癌症,是女性癌症死亡的首要原因。乳腺癌干细胞是类似于成体干细胞特性的一类细胞,具有自我更新、多向分化以及体内成瘤的能力。P63是P53抑癌基因的同源物,它有两种主要的亚型:具有反式激活结构域的亚型(TAP63)和不具有反式激活结构域的亚型(ΔNP63)。之前研究表明,ΔNP63α在乳腺癌中表达最丰富,是肿瘤干细胞和肿瘤发生的关键基因。赖氨酸甲基转移酶SETDB2是SUV亚家族成员,介导组蛋白H3K9甲基化和非组蛋白ΔNP63的甲基化。我们课题组前期已经报道SETDB2能够增加ΔNP63的稳定性,但其机制还不清楚。方法:1、用免疫亲和纯化结合质谱分析鉴定SETDB2的相互作用蛋白;2、蛋白免疫沉淀验证SETDB2与OTUD4、OTUD4与ΔNp63α之间的相互作用;3、用泛素化实验检测OTUD4对ΔNp63α的去泛素化作用;4、构建OTUD4的敲低稳系;5、用微球体形成实验分析OTUD4敲低对乳腺癌细胞成球能力的影响;6、用流式细胞仪检测OTUD4敲低对乳腺癌干细胞形成的影响;7、用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132处理乳腺癌细胞,检测OTUD4对ΔNp63α稳定性的影响;8、用Q-PCR验证OTUD4敲低对ΔNp63α下游基因的影响。结果:1、经过免疫亲和纯化结合质谱分析鉴定组蛋白甲基转移酶SETDB2的相互作用蛋白——去泛素化酶蛋白OTUD4,免疫共沉淀分析发现OTUD4与SETDB2有相互作用;2、OTUD4与ΔNp63α存在相互作用,且SETDB2能加强OTUD4与ΔNp63α的相互作用;3、OTUD4可以稳定ΔNp63α,进而上调ΔNp63α下游靶基因Ptch1、FOXN3、WISP2和SELENBP1的转录水平;4、OTUD4敲低明显降低乳腺癌细胞的干性。结论:SETDB2招募OTUD4并增强OTUD4与ΔNp63α的相互作用稳定ΔNp63α,维持乳腺癌干细胞。图[7]表[18]参[64]

关键词：乳腺癌乳腺癌干细胞 OTUD4 ΔNp63α

基于Loxp-Cre系统的去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型的构建

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军事医学 2018年第10期42卷 721-726页

作者：秦书霞刘雯张令强安徽医科大学研究生院合肥230032 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京100850

目的应用Loxp-Cre系统构建去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠。方法利用Loxp-Cre系统原理,将OTUD4基因中的4号外显子选为打靶序列,将两个Lox P位点分别设在E4的两端,经打靶载体转入ES细胞、阳性克隆筛选、囊胚注射等过程,得到嵌合体小鼠,再... 详细信息

目的应用Loxp-Cre系统构建去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠。方法利用Loxp-Cre系统原理,将OTUD4基因中的4号外显子选为打靶序列,将两个Lox P位点分别设在E4的两端,经打靶载体转入ES细胞、阳性克隆筛选、囊胚注射等过程,得到嵌合体小鼠,再将嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配繁育,最终得到杂合子小鼠并进行自交得到新生F1代小鼠。然后利用PCR进行基因型鉴定,使用免疫印迹(WB)技术从蛋白水平检测OTUD4在各组织器官中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。对各基因型小鼠进行数量统计分析明确其是否符合孟德尔遗传定律,是否具有胚胎致死表型。解剖小鼠观察主要组织器官有无明显发育异常,利用HE染色观察是否具有自发的病理改变。通过葡萄糖耐受实验分析基因敲除小鼠是否具有代谢异常等。结果基因型鉴定和WB检测结果显示OTUD4基因敲除小鼠模型成功建立。杂合子小鼠自交后各基因型比例符合孟德尔定律,提示OTUD4基因敲除小鼠非胚胎致死。各组织器官大小无显著性差异,HE染色并无异常,且OTUD4基因敲除后不影响小鼠的血糖稳态。结论应用Loxp-Cre系统成功构建了OTUD4基因敲除小鼠,且小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷,各器官无显著病理性变化,血糖代谢无异常。

关键词：泛素 Loxp-Cre OTUD4 小鼠,基因敲除聚合酶链反应基因型

去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型的构建及表型初步分析

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去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型的构建及表型初步分析

作者：刘雯军事科学院

学位级别：硕士

蛋白质的泛素化是一种可逆的翻译后修饰,参与了细胞内一系列生理反应,包括蛋白质降解、细胞信号转导、表观遗传修饰、细胞定位等,并且与多种疾病的发生发展密切相关。去泛素化酶(DUBs)是泛素化修饰的负向调节因子,理解去泛素化酶的功能... 详细信息

蛋白质的泛素化是一种可逆的翻译后修饰,参与了细胞内一系列生理反应,包括蛋白质降解、细胞信号转导、表观遗传修饰、细胞定位等,并且与多种疾病的发生发展密切相关。去泛素化酶(DUBs)是泛素化修饰的负向调节因子,理解去泛素化酶的功能和作用机制是目前的研究热点。目前已知的去泛素化酶主要包括UBP/USP家族、UCH家族、OTU家族、JAMM家族、MJD家族和MCPIP家族。其中,OTU家族作为去泛素化酶中的第二大家族,在DNA损伤修复、炎症免疫应答、代谢稳态维持、肿瘤发生发展等多个方面发挥着重要的功能。目前人源OTU家族共发现16个具有去泛素化酶催化活性的成员,主要可分为Otubains、A20-like OTUs和otuds三个亚家族,该家族成员主要通过高度保守的OTU结构域行使其去泛素化酶的催化活性,且该家族成员对底物的去泛素化修饰具有链型特异性。OTUD4是otuds亚家族中的一个成员,目前已报道的去泛素化酶OTUD4修饰的底物泛素链类型有K48型泛素链和K63型泛素链。其中,OTUD4可通过自身第202位和204位丝氨酸的磷酸化来激活其去泛素化酶活性,从而去除TLR信号通路关键接头蛋白MyD88的K63型泛素链,进而实现对先天免疫的稳态调节。此外,OTUD4还可以酶活非依赖的方式调节DNA去甲基化酶ALKBH2和ALKBH3的蛋白稳定性,进而促进DNA的烷基化损伤修复。有研究发现伴随有共济失调和低促性腺素症患者体内OTUD4基因存在非酶活突变,OTUD4基因突变是否是导致这一综合症的主要原因及其调控这一综合症的功能机制是什么仍然未知。为了深入探究OTUD4的生理功能,我们通过Cre-Loxp策略构建了去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型,并对该小鼠模型进行了初步的表型分析。我们目前的研究结论主要有:1.OTUD4基因敲除后,OTUD4小鼠能够正常出生和存活,并且其出生率符合孟德尔遗传规律;此外,与同窝OTUD4小鼠相比,OTUD4小鼠在体型、体重等方面均没有显著性差异;2.通过解剖发现,与同窝OTUD4小鼠相比,OTUD4小鼠的大脑、小脑、胸腺、肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏在重量上均没有统计学差异;3.小鼠组织病理学分析发现,OTUD4小鼠的大脑、小脑、肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏并无明显的病理学异常;4.对同窝OTUD4小鼠和OTUD4小鼠进行血象分析和血糖监测发现,OTUD4小鼠的血象和血糖也均正常。OTUD4究竟具有哪些生理功能,我们仍然还需探索。综上所述,我们采用Cre-Loxp策略首次构建了去泛素化酶OTUD4的基因敲除小鼠模型并对其表型进行了初步分析。我们的研究发现,OTUD4基因敲除后,OTUD4小鼠能够正常出生和存活,并且主要组织器官并没有明显病理学异常,小鼠血液中的成分和血糖浓度也均正常。OTUD4基因敲除小鼠模型的成功构建为进一步探究去泛素化酶OTUD4的生理功能奠定了基础。巨噬细胞是机体内重要的免疫细胞,其分布于全身的各个组织中,在机体的免疫反应中发挥着重要的功能。巨噬细胞具有较强的异质性和可塑性,即巨噬细胞在不同的组织中具有不同的形态和功能,在不同的刺激条件下,巨噬细胞的表型也存在差异。通常,人们将巨噬细胞按功能划分为经典激活的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和非经典激活的巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。在炎症反应过程中,M1型巨噬细胞通常被促炎细胞因子IFN-γ或其他微生物产物(如LPS)激活,从而呈现促炎表型,而M2型巨噬细胞通常被抑炎细胞因子如IL-4、IL-13、IL-10以及TGF-β激活,从而呈现抑炎表型。M1型和M2型是巨噬细胞极化的两个极端。巨噬细胞极化的激活和失活在免疫和炎症反应中发挥着重要的功能,目前有关调控巨噬细胞极化的分子机制研究还很有限,因此,鉴定更多调控巨噬细胞极化的分子对于更好了解巨噬细胞功能的发挥具有重要意义。CKIP-1是一个含PH结构域、与细胞骨架相关的蛋白,其参与调节细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等众多生物学过程。我们的研究发现CKIP-1是调控巨噬细胞极化的一个分子开关,其受M1和M2极化经典刺激信号的调节,并且反过来可以通过负反馈回路同时调节M1和M2型巨噬细胞极化。首先,我们通过筛选发现CKIP-1在小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDM和腹腔巨噬细胞PM中均高表达;其次,我们发现在促炎M1刺激物(如LPS和IFN-γ)诱导下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表达增加,而在抑炎M2刺激物(如IL-4和IL-13)诱导下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表达下调。此外,在生理上,我们发现巨噬细胞特异性CKIP-1缺失对抑制体内TPA诱导的皮肤炎症是不可或缺的。以上研究表明,CKIP-1是一种新的调控巨噬细胞极化的关键分子。

关键词：去泛素化酶 OTUD4 基因敲除小鼠巨噬细胞 CKIP-1 极化

去泛素化酶OTUB2对PCNA调控机制的研究

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去泛素化酶OTUB2对PCNA调控机制的研究

作者：秦书霞安徽医科大学

学位级别：硕士

泛素(Ub)-蛋白酶体系统(UPS)降解细胞内大多数可溶性蛋白质。在UPS系统中,泛素化修饰是泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)以及泛素连接酶(E3)参与介导的酶促级联反应。去泛素酶(Deubiquitylases,DUBs)调节泛素化修饰,人体内大约有100多种... 详细信息

泛素(Ub)-蛋白酶体系统(UPS)降解细胞内大多数可溶性蛋白质。在UPS系统中,泛素化修饰是泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)以及泛素连接酶(E3)参与介导的酶促级联反应。去泛素酶(Deubiquitylases,DUBs)调节泛素化修饰,人体内大约有100多种具有活性的DUBs,并且许多与人类疾病有关,如癌症和神经退行性疾病。其中,卵巢肿瘤结构域(OTU)家族是重要的信号级联调节因子。相比于其他去泛素化酶亚家族成员,OTU亚家族成员不同于其他去泛素化酶亚家族成员的独特之处是OTU亚家族大部分成员都具有很强的泛素链识别特异性。例如,otud7B通过去泛素化TRAF3调节NF-κB信号传导,OTUB1抑制非经典的依赖泛素的DNA损伤,OTULIN可以预防人和小鼠中与TNF相关的全身性炎症。目前人源OTU家族共发现16个具有去泛素化酶催化活性的成员,主要可分为Otubains、A20-like OTUs和otuds和OTULIN四个亚家族,该家族成员主要通过高度保守的OTU结构域行使其去泛素化酶的催化活性,且该家族成员对底物的去泛素化修饰具有链型特异性。其中去泛素化酶OTUB2(OTU Deubiquitinase,Ubiquitin Aldehyde Binding 2)编码234个氨基酸,分子量为28KD,在Otubain亚家族中具有很高的同源性,与其它DUB类似其具有典型的半胱氨酸酶活中心,催化核心结构域为Cys51,His224,Asn226。已知在2014年的一篇文献中发现OTUB2参与调节RAD6-RAD18介导的DNA损伤修复,在细胞内敲除OTUB2后,DNA发生损伤时能够快速募集53BP1和RAP80到达DNA损伤位点完成DNA损伤早期的非同源重组修复。OTUB2还能参与其他非典型的DNA损伤修复途径,但是其机制尚不清楚。增殖细胞核抗原(Proliferation Cell Nuclear Antigen,PCNA)是1978年在SLE(系统性红斑狼疮)患者的血清中由Miyachi等首先发现并命名的,且发现其在增殖细胞及肿瘤细胞内高表达。PCNA是细胞增殖的分子标记物,其蛋白水平随着细胞周期变化,在G1期和S期蛋白水平达到峰值。PCNA作为一种肿瘤标志物能够参与翻译后的信号传导,并且受多种翻译后修饰。在过去的十年里,越来越多的研究发现PCNA具有促进细胞生长的功能。DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。2002年Nature的一篇文献中证明RAD6途径是真核细胞中复制时DNA修复的核心,但是其机制及调控仍然知之甚少。该途径的两个至关重要的关键因子是泛素结合酶RAD6,MMS2-UBC13异二聚体,并且由RING指蛋白RAD18和RAD5招募到染色质中。PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白,是参与DNA合成和修复的重要底物。PCNA通过RAD6和RAD18进行单泛素化,通过Lys63泛素链的修饰完成多聚泛素化修饰,PCNA的多聚泛素化修饰在DNA损伤修复中的作用要远远高效于PCNA的单泛素化修饰。科学家发现PCNA的K63型泛素化修饰在依赖RAD6的DNA损伤修复中至关重要。并且已知USP1能够去除PCNA的单泛素化,而去除其多聚泛素化的DUB未知。到底是E3影响了泛素链从而影响DNA损伤修复还是DUB影响泛素链从而影响DNA损伤修复尚不清楚。由此激发了我们研究E3和DUB对DNA损伤修复的兴趣。我们的研究发现OTUB2能够通过去泛素化酶的作用调控PCNA。本文主要探讨去泛素化酶OTUB2与增殖细胞核抗原PCNA的相互作用及其对肿瘤细胞增殖的影响。为了研究PCNA与OTUB2之间存在的联系以及对生命活动的影响,我们进行了一系列的实验。我们首先通过免疫共沉淀和免疫印迹方法发现去泛素化酶OTUB2与PCNA具有相互作用。在He La细胞系内敲低OTUB2发现OTUB2能够影响PCNA的多聚泛素化修饰,结果表明OTUB2能够去除PCNA的多聚泛素化修饰,在293T细胞中过表达OTUB2和OTUB2-C51S作泛素化实验发现,OTUB2能够去除PCNA的泛素化修饰而OTUB2-C51S酶活突变体没有去除其泛素化修饰,因此OTUB2发挥去泛素化酶的作用需要依赖其半胱氨酸酶的活性,这说明OTUB2能够去除PCNA的多聚泛素化修饰并且依赖其酶活中心。过表达OTUB2后PCNA的表达没有变化,说明OTUB2并不影响PCNA的稳定性。综上所述,OTUB2与PCNA之间具有相互作用,且OTUB2能够去除PCNA的多聚泛素化修饰,不影响PCNA的稳定性。为研究DNA损伤修复过程中DUB的重要作用提供了新的方向。去泛素化酶与泛素酶在生命体内共同参与众多的生物学过程。其中去泛素化酶中的OTU亚家族成员的典型特征是其主要通过高度保守的OTU结构域行使去泛素化酶的催化功能。其中,OTUD4作为其

关键词：去泛素化酶泛素化修饰 OTUB2 PCNA 细胞增殖 OTUD4 Loxp-Cre系统基因敲除小鼠