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Targeting papain-like protease for broad-spectrum coronavirus inhibition

Protein & Cell 2022年第12期13卷 940-953页

作者： Shuofeng Yuan Xiaopan Gao Kaiming Tang Jian-Piao Cai Menglong Hu Peng Luo Lei Wen Zi-Wei Ye Cuiting Luo Jessica Oi-Ling Tsang Chris Chun-Yiu Chan Yaoqiang Huang Jianli Cao Ronghui Liang Zhenzhi Qin Bo Qin Feifei Yin Hin Chu Dong-Yan Jin Ren Sun Jasper Fuk-Woo Chan Sheng Cui Kwok-Yung Yuen State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases Li Ka Shing Faculty of MedicineThe University of Hong KongPokfulamHong Kong SARChina Department of Microbiology Li Ka ShingFaculty of MedicineThe University of Hong KongPokfulamHong Kong SARChina NHC Key Laboratory of Systems Biology of Pathogens Institute of Pathogen BiologyChinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical CollegeBeijing 100730China School of Biomedical Sciences Li Ka Shing Faculty of MedicineThe University of Hong KongPokfulamHong Kong SARChina Department of Molecular and Medical Pharmacology David Geffen School of MedicineUniversity of California Los AngelesLos AngelesCAUSA Key Laboratory of Tropical Translational Medicine of Ministry of Education Hainan Medical UniversityHaikou 571199China Academician Workstation of Hainan Province Hainan Medical UniversityHaikou 571199China Hainan Medical University-The University of Hong Kong Joint Laboratory of Tropical Infectious Diseases The University of Hong KongPokfulamHong Kong Special Administrative RegionChina Guangzhou Laboratory Guangzhou 510320China Department of Clinical Microbiology and Infection Control The University of Hong Kong-Shenzhen HospitalShenzhen 518053China

The emergence of SARS-CoV-2 variants of concern and repeated outbreaks of coronavirus epidemics in the past two decades emphasize the need for next-generation pan-coronaviral therapeutics.Drugging the multi-functional papain-like protease(PLpro)domain of the viral Nsp3 holds promise.However,none of the known coronavirus PLpro inhibitors has been shown to be in vivo active.Herein,we screened a structurally diverse library of 50,080 compounds for potential coronavirus PLpro inhibitors and identified a noncovalent lead inhibitor F0213 that has broad-spectrum anti-coronaviral activity,including against the Sarbecoviruses(SARSCoV-1 and SARS-CoV-2),Merbecovirus(MERS-CoV),as well as the Alphacoronavirus(hCoV-229E and hCoVOC43).Importantly,F0213 confers protection in both SARS-CoV-2-infected hamsters and MERS-CoV-infected human DPP4-knockin mice.F0213 possesses a dual therapeutic functionality that suppresses coronavirus replication via blocking viral polyprotein cleavage,as well as promoting antiviral immunity by antagonizing the PLpro deubiquitinase activity.Despite the significant difference of substrate recognition,mode of inhibition studies suggest that F0213 is a competitive inhibitor against SARS2-PLpro via binding with the 157K amino acid residue,whereas an allosteric inhibitor of MERSPLpro interacting with its 271E position.Our proof-ofconcept findings demonstrated that PLpro is a valid target for the development of broad-spectrum anticoronavirus agents.The orally administered F0213 may serve as a promising lead compound for combating the ongoing COVID-19 pandemic and future coronavirus outbreaks.

关键词： protease inhibitor coronavirus Nsp3 antiviral

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PRRSV degrades MDA5 via dual autophagy receptors P62 and CCT2 to evade antiviral innate immunity

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Virologica Sinica 2024年第2期39卷 264-276页

作者： Ruiqi Sun Yanyu Guo Lilin Zhang Huixia Zhang Boxuan Yin Xiaoyang Li Changyan Li Liu Yang Lei Zhang Zexing Li Jinhai Huang School of Life Sciences Tianjin UniversityTianjin300072China

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)is a major economically devastating pathogen that has evolved various strategies to evade innate immunity.Downregulation of antiviral interferon largely promotes PRRSV immunoevasion by utilizing cytoplasmic melanoma differentiation-associated gene 5(MDA5),a receptor that senses viral RNA.In this study,the downregulated transcription and expression levels of porcine MDA5 in PRRSV infection were observed,and the detailed mechanisms were explored.We found that the interaction between P62 and MDA5 is enhanced due to two factors:the phosphorylation modification of the autophagic receptor P62 by the upregulated kinase CK2αand the K63 ubiquitination of porcine MDA5 catalyzed by the E3 ubiquitinase TRIM21 in PRRSV-infected cells.As a result of these modifications,the classic P62-mediated autophagy is triggered.Additionally,porcine MDA5 interacts with the chaperonin containing TCP1 subunit 2(CCT2),which is enhanced by PRRSV Nsp3.This interaction promotes the aggregate formation and autophagic clearance of MDA5-CCT2-Nsp3 independently of ubiquitination.In summary,enhanced MDA5 degradation occurs in PRRSV infection via two autophagic pathways:the binding of MDA5 with the autophagy receptor P62 and the aggrephagy receptor CCT2,leading to intense innate immune suppression.The research reveals a novel mechanism of immune evasion in PRRSV infection and provides fundamental insights for the development of new vaccines or therapeutic strategies.

关键词： Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) Nsp3 Autophagy MDA5

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Integrative Multi-omics Landscape of Non-structural Protein 3 of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronaviruses

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Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021年第5期19卷 707-726页

作者： Ruona Shi Zhenhuan Feng Xiaofei Zhang CAS Key Laboratory of Regenerative Biology Guangdong Provincial Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative MedicineCenter for Cell Lineage and DevelopmentGuangzhou Institutes of Biomedicine and HealthChinese Academy of SciencesGuangzhou 510530China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Center for Cell Lineage and Atlas Bioland LaboratoryGuangzhou Regenerative Medicine and Health Guangdong LaboratoryGuangzhou 510530China

The coronavirus disease 2019(COVID-19)caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)infection is currently a global pandemic.Extensive investigations have been performed to study the clinical and cellular effects of SARS-CoV-2 infection.Mass spectrometry-based proteomics studies have revealed the cellular changes due to the infection and identified a plethora of interactors for all SARS-CoV-2 components,except for the longest non-structural protein 3(Nsp3).Here,we expressed the full-length Nsp3 proteins of SARS-CoV and SARS-CoV-2 to investigate their unique and shared functions using multi-omics methods.We conducted interactome,phosphoproteome,ubiquitylome,transcriptome,and proteome analyses of Nsp3-expressing cells.We found that Nsp3 plays essential roles in cellular functions such as RNA metabolism and immune response(e.g.,NF-κB signal transduction).Interestingly,we showed that SARS-CoV-2 Nsp3 has both endoplasmic reticulum and mitochondrial localizations.In addition,SARS-CoV-2 Nsp3 is more closely related to mitochondrial ribosomal proteins,whereas SARS-CoV Nsp3 is related to the cytosolic ribosomal proteins.In summary,our integrative multi-omics study of Nsp3 improves the understanding of the functions of Nsp3 and offers potential targets for the development of anti-SARS strategies.

关键词： Nsp3 SARS-CoV-2 SARS-CoV Multi-omics Mitochondria

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基于盖他病毒Nsp3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2023年第9期45卷 910-915,929页

作者：魏新宇王铭杜炳辰史智宾杨德成王靖飞东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的Nsp3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-Nsp3并经... 详细信息

为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的Nsp3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-Nsp3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品,采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度,初步建立了一种基于GETV Nsp3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板,利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测,结果显示,仅GETV为阳性,SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性,表明该方法特异性较强;分别以10倍倍比稀释(3.07×10^(-1)拷贝/μL~3.07×10^(8)拷贝/μL)的重组质粒标准品p ET29a-Nsp3作为模板,利用本研究建立的方法和普通RT-PCR方法分别检测,结果显示,本研究建立的方法对重组质粒标准品的检测限为30.7拷贝/μL,敏感性是普通RT-PCR的100倍,敏感性较高;分别以同一时间及不同时间提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的荧光定量RT-PCR进行组内与组间的重复性试验检测,结果显示,该方法的组内组间变异系数均小于2%,重复性较好。利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法分别对来源于GETV感染小鼠的84份组织样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,该TaqMan荧光定量RT-PCR方法对GETV检出率为95.24%(80/84),而普通RT-PCR对GETV的检出率为67.86%(57/84)。二者的阳性符合率达100%。本研究首次基于GETV Nsp3基因建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为GETV的检测提供了有效工具。

关键词：盖他病毒荧光定量RT-PCR Nsp3 检测方法

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轮状病毒Nsp3蛋白抑制Ⅰ型干扰素信号通路的机制研究

轮状病毒NSP3蛋白抑制Ⅰ型干扰素信号通路的机制研究

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作者：李凤迪西北民族大学

学位级别：硕士

轮状病毒（Rotavirus,RV）属呼肠孤病毒科,轮状病毒属,基因组由11段双链核糖核酸（Double-stranded RNA,ds RNA）组成,共编码12种蛋白,包括6种结构蛋白（VP1～VP4,VP6及VP7）和6种非结构蛋白（nsp1～nsp6）。轮状病毒是引起幼儿和动物... 详细信息

轮状病毒（Rotavirus,RV）属呼肠孤病毒科,轮状病毒属,基因组由11段双链核糖核酸（Double-stranded RNA,ds RNA）组成,共编码12种蛋白,包括6种结构蛋白（VP1～VP4,VP6及VP7）和6种非结构蛋白（nsp1～nsp6）。轮状病毒是引起幼儿和动物幼畜病毒性腹泻的重要病原体之一。前人研究发现nsp1蛋白具有抑制IFN-β信号通路的功能,但是否其他蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路功能有影响,有待进一步研究。本研究的目的是探究RV编码蛋白调控Ⅰ型干扰素信号通路的作用机制。本论文通过RT-PCR技术获得SA11毒株的RV目的基因,构建真核表达质粒,利用双荧光素酶报告系统、蛋白互作和磷酸化试验等研究方法和技术手段,对轮状病毒编码蛋白在IFN-I信号通路的调控作用机制进行讨论。主要包括两个部分:第一,构建RV SA11毒株编码蛋白真核表达载体,筛选对IFN-I信号通路有调控作用的SA11毒株轮状病毒蛋白;第二,研究SA11毒株轮状病毒蛋白Nsp3对调控IFN-I信号通路作用机制,现将研究内容总结如下:1.本研究以SA11毒株的RV为研究材料,采用RT-PCR方法获得目的基因VP4、VP6、VP7、nsp1、nsp2、Nsp3、nsp4、nsp5和nsp6,构建真核表达质粒p RK-Flag-VP4,p RK-Flag/HA-VP6,p RK-Flag/HA-VP7,p RK-Flag/HA-nsp1,p RK-Flag-nsp2,p RK-Flag/HA-Nsp3,p RK-Flag/HA-nsp4,p RK-HA-nsp5,p RK-HA-nsp6,Western blotting证明以上蛋白成功在HEK293T中表达。将以上重组质粒与IFN-β-Luc/ISRE-Luc质粒共转染至HEK239T细胞,经RIG-IN（RIG-I活化结构域）的刺激后利用双荧光素酶报告基因系统判定其蛋白对IFN-β/ISRE报告基因活性的影响。综上得出,真核表达质粒p RK-Flag-nsp1和p RK-Flag-Nsp3可显著降低RIG-IN诱导的双荧光素酶活性。nsp1和Nsp3蛋白可抑制RIG-IN刺激的IFN-β和ISRE启动子活性,证明Nsp3蛋白具有抑制IFN-β信号通路的功能。2.本研究以SA11毒株为研究材料,明确真核表达质粒p RK-Flag/HA-Nsp3调控I型干扰素信号通路的机制作用影响。基于ISRE和IFN-β双荧光素酶报告基因系统,检测信号分子介导的报告基因实验的呈剂量依赖效果,作用在MAVS上游。随后在HEK293T细胞中过表达Nsp3蛋白,检测关键分子IRF3和IκBα磷酸化水平,结果显示Nsp3蛋白抑制Se V介导的IRF3和IκBα的磷酸化。通过荧光定量PCR检测了RLRs信号通路中IFN-β的m RNA水平以及其下游ISGs（ISG56、CXCL10、OASL）的m RNA水平,在Nsp3蛋白存在情况下表达量的变化,结果显示Nsp3蛋白显著抑制由Se V、RIG-IN、MDA5-N刺激的IFNB1、IFIT2、CXCL10的表达。最后通过细胞降解实验,发现Nsp3蛋白和RIG-I作用不与其他信号分子作用。综上得出,Nsp3蛋白具有下调RNA病毒介导的干扰素产生的功能。

关键词：轮状病毒 SA11毒株 Nsp3 IFN-β RLRs信号通路

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猪流行性腹泻病毒结构与非结构蛋白诱导细胞凋亡的研究

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畜牧与兽医 2023年第1期55卷 60-68页

作者：欧芳玲朱慧欣李紫彤刘星王先炜南京农业大学/农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为了弄清猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后诱导细胞凋亡的关键蛋白,采用基因克隆技术构建PEDV相关病毒蛋白的真核表达质粒,转染至HEK-293T细胞,通过流式细胞术检测其细胞凋亡率。结果显示:PEDV非结构蛋白Nsp3和nsp5以及结构蛋白M的重组质... 详细信息

为了弄清猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后诱导细胞凋亡的关键蛋白,采用基因克隆技术构建PEDV相关病毒蛋白的真核表达质粒,转染至HEK-293T细胞,通过流式细胞术检测其细胞凋亡率。结果显示:PEDV非结构蛋白Nsp3和nsp5以及结构蛋白M的重组质粒转染细胞后显著诱导细胞凋亡,且诱导的细胞凋亡呈现时间和剂量依赖性,提示Nsp3、nsp5和M蛋白可能是PEDV的关键促凋亡因子。该结果为进一步研究PEDV诱导细胞凋亡的分子机制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒细胞凋亡 Nsp3 nsp5 M蛋白

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基于Nsp3的轮状病毒载体的研究

基于NSP3的轮状病毒载体的研究

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作者：杜文静甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:建立轮状病毒(SA11株)反向遗传学操作平台,利用已建立的反向遗传平台,研究轮状病毒非结构蛋白Nsp3插入外源基因的可行性,为轮状病毒作为载体的研究奠定基础。方法:1.利用轮状病毒反向遗传学12质粒系统体外转染BHK/T7-9细胞拯救r S... 详细信息

目的:建立轮状病毒(SA11株)反向遗传学操作平台,利用已建立的反向遗传平台,研究轮状病毒非结构蛋白Nsp3插入外源基因的可行性,为轮状病毒作为载体的研究奠定基础。方法:1.利用轮状病毒反向遗传学12质粒系统体外转染BHK/T7-9细胞拯救r SA11、r SA11/Nsp3-EGFP病毒,通过镜下观察细胞病变、Western blotting、核酸银染、蚀斑实验、电镜及病毒一步生长曲线等对重组病毒进行生物学特性鉴定;2.通过同源重组构建质粒p T7-Nsp3-No V-P dimer/SA11,体外转染r SA11/Nsp3-No V-P dimer进行病毒拯救。结果:1.成功拯救r SA11病毒,与野生型SA11相比,r SA11病毒接种后镜下观察可见典型病变;Western blotting鉴定可见VP6蛋白表达;核酸银染法获得r SA11病毒呈现典型的4-2-3-2分布;蚀斑实验可见r SA11病毒形成明显空斑;电镜观察可见清晰轮状病毒粒子;TCID法绘制一步生长曲线发现病毒在12 h开始增殖并在36 h达到病毒繁殖平台期。2.成功拯救r SA11/Nsp3-EGFP病毒,与野生型SA11病毒相比,r SA11/Nsp3-EGFP病毒接种后镜下可见典型病变及EGFP表达;Western blotting鉴定可见VP6蛋白与EGFP均有表达;核酸银染法获得r SA11/Nsp3-EGFP病毒呈现典型的A组轮状病毒核酸条带,并可见Nsp3条带的迁移;蚀斑实验显示r SA11/Nsp3-EGFP病毒空斑数量略少于野生型SA11病毒;电镜观察可见清晰轮状病毒粒子;TCID法绘制一步生长曲线发现病毒在12 h开始增殖并在36 h达到病毒繁殖平台期,但其病毒滴度略低于野生型SA11病毒。3.成功构建质粒p T7-Nsp3-No V-P dimer/SA11,并对r SA11/Nsp3-No V-P dimer进行病毒拯救,但尝试多次,均未拯救出相关病毒。结论:获得了2株r SA11和r SA11/Nsp3-EGFP病毒;拯救的r SA11病毒与野生型SA11病毒具有相似的生物学特性;拯救的r SA11/Nsp3-EGFP病毒滴度低于野生型SA11病毒;成功构建质粒p T7-Nsp3-No V-P dimer/SA11,并对其进行多次实验,未拯救出相关病毒。这对于Nsp3插入外源基因的研究提供基础,本研究为探索RV毒力、致病力及载体疫苗研发等具有重要科学价值和公共卫生意义。

关键词：轮状病毒反向遗传学 Nsp3 病毒拯救鉴定

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猪轮状病毒Nsp3和nsp5蛋白单抗的制备及抗原表位鉴定

猪轮状病毒NSP3和NSP5蛋白单抗的制备及抗原表位鉴定

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作者：谷凤丽东北农业大学

学位级别：硕士

轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)成员,是重要的病原体,可以引起多种宿主生物的病毒性腹泻,如哺乳动物和鸟类。猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,Po RV)是引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等症状的主要病原... 详细信息

轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)成员,是重要的病原体,可以引起多种宿主生物的病毒性腹泻,如哺乳动物和鸟类。猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,Po RV)是引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等症状的主要病原,致死率高,为猪的主要传染病之一,使我国的养猪业遭受了沉重的打击。RV为双链的RNA病毒,RV基因组是由11段每段均含有一个开放阅读框、不连续的双股RNA所构成,并编码6种结构蛋白以及6种非结构蛋白。Nsp3是RV的非结构蛋白,是一种非糖基化蛋白,该蛋白与病毒粒子感染细胞有关,能够关闭宿主细胞mRNA的翻译。非结构蛋白nsp5,主要功能是糖基化和磷酸化的修饰作用,多在RV翻译后期进行参与。其C端富含保守的丝氨酸和苏氨酸多聚化结构域,参与翻译后期的磷酸化和糖基化修饰,nsp5的存在可使病毒的复制转录等过程顺利进行,在病毒的复制周期中起着不可或缺的作用。本研究旨在获得抗Po RV(G9)血清型NMTL毒株纯度高特异性强的单克隆抗体(MAb),加深对Nsp3、nsp5蛋白结构和功能的了解,并对它们的免疫学特性进行了更深一步的研究。本研究采用RT-PCR方法扩增了G9血清型Nsp3和nsp5基因,经酶切后分别连接至p GEX-6P-1载体中构建重组表达质粒p GEX-Nsp3和p GEX-nsp5。酶切鉴定后进行测序,获得测序正确的阳性质粒。将其分别转化至E.coli DH5α感受态细胞,经IPTG进行Nsp3重组蛋白(r Nsp3)和nsp5重组蛋白(r nsp5)的诱导表达,并设置空载体为对照。将r Nsp3和r nsp5经SDS-PAGE分析后进行纯化,结果显示:r Nsp3和r nsp5大小分别为60Ku和50Ku。将rNsp3和r nsp5分别与抗RV的阳性血清进行western blot试验,均发生反应,结果表明其具有良好的免疫源性。将含有r Nsp3和r nsp5条带的SDS-PAGE胶捣碎后,采用皮下注射的方法免疫BALB/c小鼠,免疫3次后断尾取血,间接ELISA检测抗体效价后,进行加强免疫于融合的前3d。取加强免疫后小鼠的脾细胞与生长状态较好的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,利用间接ELISA方法进行筛选,得到1株能稳定分泌抗Po RV(G9)Nsp3的杂交瘤细胞株5B8和1株能稳定分泌抗nsp5的杂交瘤细胞株5E11,均为Ig G1亚类。Western blot及间接免疫荧光(IFA)结果表明,所获得的MAbs特异性良好。为确定获得的MAb所针对的抗原表位的区域序列,采用Western blot试验分别对截短表达后的Nsp3和nsp5蛋白进行一系列的鉴定。结果表明,5B8识别的抗原表位序列为290QDYDRTFL 297,5E11识别的抗原表位序列为61 GPSDSA 66。本研究分别成功制备了一株抗Nsp3蛋白和一株抗nsp5蛋白的MAb,并对它们的线性抗原表位进行了鉴定。为RV的抗病毒免疫研究、抗体检测等均提供了信息及材料,同时也为进一步对Nsp3和nsp5蛋白的结构和功能的研究奠定了良好的基础。

关键词：猪轮状病毒 Nsp3 nsp5 单克隆抗体抗原表位

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miR-125a-3p及其靶基因PTB在轮状病毒复制调控中的作用机制研究

miR-125a-3p及其靶基因PTB在轮状病毒复制调控中的作用机制研究

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作者：刘雅琳北京协和医学院

学位级别：硕士

轮状病毒（Rotavirus,RV）是一种无包膜的二十面体形状的双链RNA病毒,是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体。有关RV感染细胞后的复制机制尚不十分清楚。有研究表明,病毒在宿主细胞中的复制与细胞代谢的某些环节相关,其中细胞miRNAs表... 详细信息

轮状病毒（Rotavirus,RV）是一种无包膜的二十面体形状的双链RNA病毒,是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体。有关RV感染细胞后的复制机制尚不十分清楚。有研究表明,病毒在宿主细胞中的复制与细胞代谢的某些环节相关,其中细胞miRNAs表达水平是主要因素。miRNAs是一类长度约为22个碱基的非编码小RNA分子,其作用可调节细胞代谢过程过程中的转录,进而影响细胞分裂过程。病毒也许正是通过改变细胞miRNAs的表达,操控宿主细胞蛋白水平的表达,达到促进自身复制的目的。RV感染后是否引起细胞miRNAs表达的改变,miRNAs作用的靶点是什么,通过什么途径进行调控以影响RV的复制。在我们的前期研究中发现RV感染细胞后,宿主细胞miR-125a-3p表达水平下调,并且miR-125a-3p与RV的作用关系尚不明确,针对这一现象展开了较深入的研究。本论文研究目的探讨miR-125a-3p在RV感染细胞后下调的真实性,寻找该分子的作用靶点,相互作用机制及在RV复制过程中的作用关系。研究方法:用RV毒株（ZTR-68）G1P[8]型（源于流行地区的致病毒株）感染MA104细胞（恒河猴肾细胞,对RV敏感）后,检测宿细胞miRNAs的表达谱,深度测序确定表达差异的miRNA分子。用miRanda软件进行比较预测寻找miRNAs可能作用靶点。经双荧光素酶报告系统验证miRNA分子与其靶基因的关系,进一步利用体外转染该分子模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）评价下游靶基因的表达。RT-qPCR、免疫荧光等方法检测靶基因的表达,以及通过上下调靶基因检测RV的复制情况。用免疫共沉淀法探测了靶基因与RV相互作用关系的结合位点。研究结果:RV感染MA104细胞后,miRNAs有表达差异,深度测序表示:该差异分子为miR-125a-3p,且miR-125a-3p能够抑制RV的复制;miRanda预测提示多聚嘧啶结合蛋白（PTB）是该分子的可能靶点。双荧光素酶报告系统证实二者存在靶定关系,经过表达和抑制表达miR-125a-3p发现,miR-125a-3p能下调PTB的表达;PTB在感染早期定位于胞核,后期迁移出至胞质。通过调节PTB的表达试验证实,PTB能促进RV复制。经免疫共沉淀试验明确了 PTB作用于RV非结构蛋白Nsp3,二者协同促进病毒的复制。结论:miR-125a-3p是宿主细胞抗病毒复制的主要因素,对病毒复制起到抑制作用。RV感染细胞后,通过下调宿主细胞miR-125a-3p表达,解除对靶基因PTB的抑制,影响宿主细胞蛋白翻译以促进病毒自身蛋白的翻译,装配形成完整的子代病毒。该研究结果有助于了解揭示RV感染细胞复制机理,也可为寻找抗RV药物靶点提供线索。

关键词：轮状病毒 miR-125a-3p PTB Nsp3

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轮状病毒非结构蛋白Nsp3的重组表达及免疫学性质研究

轮状病毒非结构蛋白NSP3的重组表达及免疫学性质研究

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作者：于洋中国协和医科大学

学位级别：硕士

轮状病毒属于呼肠病毒科，是世界范围内引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体，每年全世界死于轮状病毒感染的儿童约达611000。轮状病毒具有三层衣壳，其基因组由11个分节段的双链RNA组成，编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白。根据交叉反应性... 详细信息

轮状病毒属于呼肠病毒科，是世界范围内引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体，每年全世界死于轮状病毒感染的儿童约达611000。轮状病毒具有三层衣壳，其基因组由11个分节段的双链RNA组成，编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白。根据交叉反应性抗原的不同，轮状病毒分为A-G 7个组，其中只有A、B、C三个组可以感染人类，而引起婴幼儿腹泻的主要为A组，该组是最常见也是最为重要的。A组轮状病毒非结构蛋白Nsp3为分子量36kDa的同二聚体，其N端可以结合轮状病毒mRNA3’末端的组特异性四核苷酸共有序列，C端与poly(A)结合蛋白竞争结合真核翻译起始因子eIF4G。Nsp3能够关闭宿主细胞mRNA的翻译，并且可能在轮状病毒基因组复制和病毒形态发生中起重要作用。本研究克隆了A组人轮状病毒TB-Chen株Nsp3编码基因，应用质粒pETL作为表达载体构建了重组表达质粒pET-Nsp3，并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组蛋白Nsp3，目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的28.6％。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离回收的方法有效地纯化了目的蛋白，并制备了该重组蛋白的免疫豚鼠血清抗体，Western blot分析显示该血清抗体能与重组蛋白Nsp3发生特异性免疫反应。免疫荧光实验显示在轮状病毒感染的MA104细胞中Nsp3分布在整个细胞质中。Nsp3在细胞质中分布形式不一致：有的分布弥散、均匀;有的既有弥散分布，又呈现颗粒状，并且这些颗粒更多地出现在细胞核周围。这些结果为进一步研究TB-Chen株轮状病毒Nsp3的结构、功能和免疫学性质奠定了基础。

关键词：轮状病毒非结构蛋白 Nsp3 重组表达免疫反应性免疫荧光

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