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棉花nsltp家族基因全基因组鉴定及其表达特征分析

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棉花nsLTP家族基因全基因组鉴定及其表达特征分析

作者：程朝泽南京农业大学

学位级别：硕士

非特异性脂类转运蛋白(nsltp)是植物特有的一类蛋白,其生物学功能具有多样性。nsltp基因能够促进脂类物质的跨膜转运,从而参与植株对逆境条件的抗性、促进豆科植物根瘤的形成、促进花粉管伸长等。目前,在其它作物中已经对nsltp家族基因... 详细信息

非特异性脂类转运蛋白(nsltp)是植物特有的一类蛋白,其生物学功能具有多样性。nsltp基因能够促进脂类物质的跨膜转运,从而参与植株对逆境条件的抗性、促进豆科植物根瘤的形成、促进花粉管伸长等。目前,在其它作物中已经对nsltp家族基因进行了较为系统的研究,并筛选和验证了一些具有重要生物学功能的家族成员。棉花是重要的经济作物,棉纤维是世界上最重要的天然纺织原料。然而,对nsltp基因在棉花发育过程中的作用仍然报道较少,少数研究表明,nsltp可能与棉纤维伸长相关。本研究利用已经完成全基因组测序的三个棉种基因组数据,结合相应生物信息学分析方法技术,分别鉴定、分析了三个棉种中nsltp家族基因及系统进化特征,对陆地棉nsltp基因表达特征进行了分析验证,筛选了可能参与棉花非生物胁迫抗性及棉纤维起始发育过程的nsltp基因。1.利用生物信息学分析方法在陆地棉、亚洲棉、雷蒙德氏棉三个棉种分别获得了153、76、83个nsltp家族基因成员。根据nsltp家族基因系统分类法将陆地棉nsltp基因分为14类,每类基因都对应地包含了相似的保守特征。Ka/Ks分析显示,nsltp家族基因在进化上非常的保守,分子进化树显示Ⅳ类和含有GPI修饰位点的nsltp基因出现较早,而Ⅰ类和Ⅱ类形成时间稍晚。对陆地棉nsltp基因进行GO富集分析,结果显示LTP基因主要参与细胞脂质转运。启动子分析表明,nsltp能够响应盐旱等逆境条件、激素处理诱导,也受MYB转录因子调控,某些基因还存在组织特异性表达调控元件。2.利用本实验室的陆地棉转录组数据,对nsltp基因的时空表达、非生物胁迫及激素诱导表达进行了分析。nsltp基因在陆地棉不同组织器官中表达数据表明,陆地棉nsltp基因家族存在明显的时空优势表达。表达聚类分析发现,Ⅰ、Ⅴ类和部分Ⅱ类nsltp基因在根、茎、叶中优势表达,可能与棉花营养生长相关,Ⅲ、G类nsltp基因在棉纤维发育中优势表达,部分Ⅱ类nsltp基因在花粉中优势表达,Ⅳ、Ⅴ类基因在胚珠发育早期优势表达。另一方面,逆境处理陆地棉转录组数据显示nsltp基因能被一种或多种逆境条件诱导,同时试验证明nsltp基因表达也受激素诱导,推测nsltp基因处于逆境应激信号通路下游,参与下游信号传递或是本身就是功能效应器。3.使用qRT-PCR技术对陆地棉nsltp基因家族中时空特异性表达和逆境响应表达显著的nsltp基因进行了进一步分析。结果表明,9个nsltp家族基因显著受时空特异性及逆境响应表达,其中2个参与时空特异性表达,7个受逆境响应表达。利用纤维突变体材料筛选nsltp基因并进行定量验证,发现GhLtpL17At、GhLtpIV2At这两个基因跟纤维发育起始有关。同时,我们发现分别有4个nsltp基因显著受到干旱、高盐胁迫诱导。进一步分析发现,其中GhLtpGe.1Dt、GhLtpL13At、GhLtpIV.2Dt三个nsltp基因也受到多种激素诱导。高通量数据和定量结果都显示nsltp基因在棉纤维发育或棉花抗逆方面可能具有重要的生物功能。本研究在系统鉴定和分析nsltp基因家族的基础上,筛选出了可能参与棉纤维起始和非生物胁迫抗性的重要nsltp基因,为进一步利用nsltp基因改良棉花纤维品质和抗逆性等重要农艺性状奠定了研究基础。

关键词：棉花 nsltp 表达分析纤维起始非生物胁迫

Bioinformatics and Expression Pattern Analysis of Tomato ns LTP 2-like cDNA full-length Gene Clone

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Journal of Northeast Agricultural University(English Edition) 2019年第1期26卷 28-36页

作者： Zhang Jia He Shan-shan Zhao Ting-ting Jiang Jing-bin Li Jing-fu Xu Xiang-yang College of Horticulture and Landscape Architecture Northeast Agricultural University

TDF1(transcription-drived fragment) was homologous to the predicted S. lycopersicum nonspecific lipid-transfer protein,nsltp 2-like(91%), and it was significantly upregulated in response to C. fulvum(cladosporium fulvum) infection in tomato *** this experiment, the full-length cDNA of nsltp 2-like was cloned using RACE technology based on the sequence of TDF1(GenBank: JZ717725). A full-length, 625 bp(GenBank: KU366289), cDNA sequence, which with 98% similarity to nsltp 2-like gene(GenBank: XM015233692) was obtained. This cDNA contains an ORF(open reading frame) with full-length of 345 bp, coding of 114 amino acids, including 12.3% Ala and Gly. Protein molecular weight was 11.51 ku, the isoelectric point(pI) was 8.99, and average overall hydrophilicity was 0.412, with one phosphorylation sites, belonging to volatile acidic nuclear protein. Secondary structure prediction showed that α-Helix accounts for 30.7%, extension chain for 12.28%, β-corner for 9.65%, and random coil for 47.37%. Through comparative analysis of the homology among species, it was found that the amino acid sequence of tomato nsltp 2-like protein had a high similarity with other plants, and with a specific conserved sequence which might related features in nsltp 2-like protein. It also be analyzed the gene expression pattern of tomato in different parts and under different stress *** results showed that nsltp 2-like gene was up-regulated in varying degrees, under the condition of cold stress, exogenous hormone spraying and cladosporium fulvum infection. Therefore, it was speculated that the gene played a role in response to abiotic and biotic stress in tomato.

关键词： tomato nsltp 2-like cDNA clone bioinformatics analysis expression pattern

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杨树nsltps的分子特征和功能分析

分子植物育种 2023年

作者：陈金鑫刘世薇张兴月刘国元余春梅张健魏辉南通大学生命科学学院南通市观赏植物遗传育种重点实验室

非特异性脂质转移蛋白(Non-specific lipid transfer proteins， nsltps)是一种植物界广泛存在的脂质转移蛋白，参与脂质的运输，并与植物生长发育和非生物胁迫密切相关。尽管nsltps在多种植物中被发现，但目前对杨树nsltps的研究较少... 详细信息

非特异性脂质转移蛋白(Non-specific lipid transfer proteins， nsltps)是一种植物界广泛存在的脂质转移蛋白，参与脂质的运输，并与植物生长发育和非生物胁迫密切相关。尽管nsltps在多种植物中被发现，但目前对杨树nsltps的研究较少，本研究从杨树中克隆得到PtLTP基因(XM＿006387137)，在原核表达系统中诱导表达和纯化了呈可溶形式的PtLTP。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析表明，该基因的转录水平具有明显的组织特异性，主要在茎中表达，叶片中表达量次之，而根中几乎检测不到。进一步分析了ABA、NaCl、H2O2处理对PtLTP表达的影响，当使用ABA处理时，PtLTP的表达量是未处理前的数十倍，PtLTP的高表达揭示了PtLTP在协助ABA整合各种胁迫信号和调控下游胁迫反应时发挥着重要作用。同样的，NaCl处理组有着与ABA处理组相似的变化趋势，而H2O2处理组则是在处理后12 h其相对表达量出现了明显的降低，在24 h达到峰值后再次降低。这些结果表明PtLTP在调控非生物胁迫条件的响应中发挥着潜在的作用。本研究将为杨树nsltp基因的进一步研究提供基础依据。

关键词：杨树 nsltp 基因克隆原核表达非生物胁迫

Bioinformatic identification and analyses of the non-specific lipid transfer proteins in wheat

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Journal of Integrative Agriculture 2020年第5期19卷 1170-1185页

作者： FANG Zheng-wu HE Yi-qin LIU Yi-ke JIANG Wen-qiang SONG Jing-han WANG Shu-ping MA Dong-fang YIN Jun-liang Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry/Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland Ministry of Education/Hubei Engineering Research Center for Pest Forewarning and Management/College of AgricultureYangtze UniversityJingzhou 434025P.R.China Institute of Food Crops Hubei Academy of Agricultural SciencesWuhan 430064P.R.China Institute of Plant Protection Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management of Crop in Southwest ChinaMinistry of Agriculture and Rural AffairsChengdu 610066P.R.China

Non-specific lipid transfer proteins(nsltps/LTPs) that can transport various phospholipids across the membrane in vitro are widespread in the plant kingdom, and they play important roles in many biological processes that are closely related to plant growth and development. Recently, nsltps have been shown to respond to different forms of abiotic stresses. Despite the vital roles of nsltps in many plants, little is known about the nsltps in wheat. In this study, 330 nsltp proteins were identified in wheat and they clustered into five types(1, 2, c, d, and g) by phylogenetic analysis with the nsltps from maize, Arabidopsis, and rice. The wheat nsltps of type d included three subtypes(d1, d2, and d3) and type g included seven subtypes(g1–g7). Genetic structure and motif pattern analyses showed that members of each type had similar structural composition. Moreover, GPI-anchors were found to exist in non-g type members from wheat for the first time. Chromosome mapping revealed that all five types were unevenly and unequally distributed on 21 chromosomes. Furthermore, gene duplication events contributed to the proliferation of the nsltp genes. Large-scale data mining of RNA-seq data covering multiple growth stages and numerous stress treatments showed that the transcript levels of some of the nsltp genes could be strongly induced by abiotic stresses, including drought and salinity, indicating their potential roles in mediating the responses of the wheat plants to these abiotic stress conditions. These findings provide comprehensive insights into the nsltp family members in wheat, and offer candidate nsltp genes for further studies on their roles in stress resistance and potential for improving wheat breeding programs.

关键词： nsltp abiotic stress wheat genome bioinformatics gene family

A functional characterization of TaMs1 orthologs in Poaceae plants

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The Crop Journal 2021年第6期9卷 1291-1300页

作者： Jian Li Zheng Wang Zhenyi Chang Hang He Xiaoyan Tang Ligeng Ma Xing Wang Deng Peking University Institute of Advanced Agricultural Sciences Weifang 261325ShandongChina Shenzhen Institute of Molecular Crop Design Shenzhen 518107GuangdongChina College of Life Sciences Capital Normal UniversityBeijing Key Laboratory of Plant Gene Resources and Biotechnology for Carbon Reduction and Environmental ImprovementBeijing 100048China

TaMs1 encodes a non-specific lipid transfer protein(nsltp) and is required for pollen development in wheat. Although MS1 is a Poaceae-specific gene, the roles of MS1 genes in other Poaceae plants are unknown, especially in rice and maize. Here, we identified one ortholog in rice(OsLTPg29) and two orthologs in maize(ZmLTPg11 and ZmLTPx2). Similar to TaMs1, both OsLTPg29 and ZmLTPg11 genes are specifically expressed in the microsporocytes, and both OsLTPg29 and ZmLTPg11 proteins showed lipid-binding ability to phosphatidic acid and several phosphoinositides. To determine their roles in pollen development, we created osltpg29 mutants and zmltpg11 zmltpx2 double mutants by CRISPR/***29, not zmltpg11 zmltpx2, is defective in pollen development, and only OsLTPg29, not ZmLTPg11,can rescue the male sterility of tams1 mutant. Our results demonstrate that the biological function of MS1 in pollen development differs in the evolution of Poaceae plants.

关键词： MS1 Poaceae nsltp Pollen development

Differential Space-Time Expression of StLTPbl Gene Between Resistant and Susceptible Potato Genotypes in Response to Ralstonia solanacearum

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Agricultural Sciences in China 2008年第6期7卷 713-725页

作者： GAO Gang JIN Li-ping XIE Kai-yun QU Dong-yu Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 P.R.China College of Life Science Shanxi Normal University Linfen 041004 P.R.China

This study is to investigate the role of lipid transfer protein （LTP1） gene of potato （Solanum tuberosum） in bacterial wilt （Ralstonia solanacearum） resistance. A novel cDNA clone encoding nsltp was isolated from cultivated potato （Solanum tuberosum） infected with R. solanacearum by 5＇-rapid amplification of cDNA ends （RACE）. The temporal and spatial expression of StLTPbl was studied during the early stages of potato-R, solanacearum interaction by reverse transcriptase PCR （RT-PCR） and Northern blotting. The sequence analysis of the cloned cDNA, named StLTPbl, showed 691 bp which encoded a type 1 nsltp of 91 amino acids. Construction of a phylogenic tree showed that StLTPbl is well conserved in the coding region with high identity at the amino acid level with other Solanaceae nsltps. The temporal and spatial expression of StLTPbl was studied during the early stages of potato-R, solanacearum interaction. StLTPbl transcription is induced faster and transcripts accumulate to higher concentrations in resistant compared with susceptible genotypes by the pathogen. Dominant differences in the pathogen-induced gene expression pattern between the upper and lower leaves and stems were observed within the same genotypes. In situ hybridization results showed that the StLTPbl mRNA was localized in phloem cells of vascular tissues in potato leaf and stem tissues after pathogen infection. Salicylic acid, methyl jasmonate and abscisic acid could induce StLTPbl gene expression without significant difference between the upper and lower tissues. These abiotic elicitors could produce a long-lastingeffect on the StLTPbl during early stages of potato-R, solanacearum interaction. Differential expression of StLTPbl gene between resistance and susceptible potato genotypes in response to R. solanacearum suggests that this gene plays a key role in plant defense mechanisms.

关键词： Solanum tuberosum nsltp gene expression Ralstonia solanacearum

非特异性脂质转移蛋白突变体的构建及在两种硫氧还蛋白表达载体中的表达比较

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生物工程学报 2002年第2期18卷 167-171页

作者：葛晓春陈继超王文漪曹凯鸣孙崇荣复旦大学生命科学学院生物化学系上海200433

对水稻非特异性脂质转移蛋白 (Nospecificlipidtransferprotein ,nsltp)LTP110中结构重要的 5个氨基酸位点进行了定点突变 ,测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后 ,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合... 详细信息

对水稻非特异性脂质转移蛋白 (Nospecificlipidtransferprotein ,nsltp)LTP110中结构重要的 5个氨基酸位点进行了定点突变 ,测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后 ,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达。将编码野生型LTP110及突变体Y17A ,P72L ,R46A ,D45A ,C5 0A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较 :pTrxFus载体可以在宿主菌GI72 4中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A ,P72L ,R46A融合蛋白 ,但不能表达D45A和C5 0A融合蛋白 ;pET32a(+)载体可以在宿主菌BL2 1(DE3)trxB- 中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白 ,且表达量比在pTrxFus载体 GI72 4突主菌中表达量高。对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化 ,并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活。

关键词： nsltp 定点突变硫氧还蛋白融合表达载体荧光标记脂质非特异性脂质转移蛋白突变体植物

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大麦免疫蛋白的提取、分离纯化及性质研究

大麦免疫蛋白的提取、分离纯化及性质研究

作者：姜晓雷大连工业大学

学位级别：硕士

大麦是啤酒酿造的主要原料,大麦本身含有的免疫蛋白(抗菌蛋白、抗菌肽)对啤酒酵母的作用一直受到人们的关注，以前的研究表明由于这些抗菌蛋白都是一些耐热的小分子多肽，具有热稳定性，能耐受煮沸的温度，例如在啤酒发酵中能耐受麦汁... 详细信息

大麦是啤酒酿造的主要原料,大麦本身含有的免疫蛋白(抗菌蛋白、抗菌肽)对啤酒酵母的作用一直受到人们的关注，以前的研究表明由于这些抗菌蛋白都是一些耐热的小分子多肽，具有热稳定性，能耐受煮沸的温度，例如在啤酒发酵中能耐受麦汁煮沸时的温度而保留下来，在发酵过程中对酵母的生长、代谢有影响，从而导致啤酒发酵的周期延长、酵母降糖速度缓慢。本文主要从前人的方法上改进抗菌蛋白的提取率;针对几种典型的国内外大麦的抗菌蛋白含量进行了分析，检测其对酵母菌的生长代谢影响;对nsltp蛋白进行分离纯化，并检测其性质。为啤酒生产过程中出现的问题提供理论支持。本实验以澳大利亚大麦(Hordeum sp. Gairdner)为研究对象，采用稀硫酸提取、硫酸铵分级沉淀、精密排阻透析袋透析，利用响应面法，改进了抗菌粗蛋白提取方法，简便了提取步骤，提高了抗菌蛋白的提取率。以不同品种的八种国内外大麦为原料，通过对这八种大麦的抗菌粗蛋白进行提取、比较了其含量差别，检测粗蛋白的抗菌活性，并对其热稳定性进行分析。研究发现国产Danpi-2的抗菌粗蛋白含量最高，达到338μg·g，当培养基中加入32μg·mL粗蛋白时，酵母生长明显受到抑制，当培养12h后，抑制率达到了50%左右。本实验还对抗菌粗蛋白中的nsltp蛋白进行了分离纯化，采用DEAE纤维素柱、G-50葡聚糖柱、CM-葡聚糖-C50柱层析，纯化了nsltp蛋白，利用SDS-PAGE电泳显示为一条带，说明分离效果已达到电泳纯，分子量为16KDa。检测了nsltp的抗菌活性，当发酵液中nsltp含量达到100μg·mL时，酵母生长抑制率在达到50%左右。

关键词：大麦抗菌蛋白 nsltp 分离纯化

干旱胁迫下小麦种子萌发特性评价与生理响应机制

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干旱胁迫下小麦种子萌发特性评价与生理响应机制

作者：乔志新山东农业大学

学位级别：硕士

干旱胁迫是影响小麦高产稳产的主要非生物胁迫,萌发期干旱胁迫导致种子萌发延迟、发芽率降低、幼苗整齐度、健壮度下降,严重影响小麦后期生长和产量形成。目前对小麦种子萌发期干旱胁迫的响应机制研究较少。本研究对128个小麦品种进行... 详细信息

干旱胁迫是影响小麦高产稳产的主要非生物胁迫,萌发期干旱胁迫导致种子萌发延迟、发芽率降低、幼苗整齐度、健壮度下降,严重影响小麦后期生长和产量形成。目前对小麦种子萌发期干旱胁迫的响应机制研究较少。本研究对128个小麦品种进行干旱萌发特性鉴定;筛选出干旱萌发特性差异显著的品种,测定干旱胁迫下种子发芽生长指标、贮藏物质分解酶类、抗氧化酶类活性;检测种子吸胀萌动期大分子修复能力、种胚脂质代谢能力的变化,以期揭示萌发期干旱胁迫影响小麦种子萌发成苗质量的机理,为小麦耐旱品种培育、干旱胁迫下成苗壮苗调控提供新思路。研究结果如下:1.128个小麦品种干旱胁迫下种子萌发特性差异以砂培控水法进行小麦种子干旱萌发特性评价,将128个小麦品种按干旱萌发特性划分为5类,其中山农28号、长6878、百农4199等18个小麦品种干旱萌发特性好,萌发快速整齐、幼苗健壮。新麦38、良星77、乐麦185等26个小麦品种干旱萌发特性差,萌发延迟,萌发时间分散,发芽率低、幼苗健壮度差。2.干旱胁迫对不同萌发特性小麦品种大分子修复能力和抗氧化能力的影响以筛选出的干旱萌发特性差异显著的6个小麦品种(山农28号、长6878、烟农19、山农23号、鑫麦296和新麦38)为材料,研究干旱胁迫对大分子修复能力和抗氧化能力的影响,结果表明对于干旱萌发特性好的山农28号和长6878干旱胁迫下胚根突出快、萌发前期TDP1基因表达水平高、POD活性显著提高;干旱胁迫对其GE、GP、VI、吸水率无显著影响。对于干旱萌发特性差的鑫麦296和新麦38,干旱胁迫下种胚DNA和蛋白质修复基因表达水平相对滞后,萌发前期SOD活性显著低于对照;干旱胁迫下GE、GI、VI、SSDW显著降低。表明干旱胁迫下小麦吸胀萌动期种胚大分子修复能力及抗氧化能力与种子萌发速度密切相关。3.干旱胁迫下小麦种子萌发成苗过程中贮藏物质分解转化差异对不同干旱萌发特性小麦品种干旱胁迫下的贮藏物质分解转化能力研究表明,干旱胁迫对萌发特性好的山农28号和长6878的α-淀粉酶和半胱氨酸蛋白酶活性影响小,干旱萌发后期可溶性蛋白含量高;尤其山农28号的可溶性蛋白上升时间早,物质动员早于其它品种。干旱胁迫导致萌发特性差的鑫麦296和新麦38的半胱氨酸蛋白酶活性显著降低,而对可溶性蛋白含量无显著影响;此外新麦38干旱萌发后期α-淀粉酶活性也显著降低。4.干旱胁迫对不同萌发特性小麦品种种胚脂质动员的影响对干旱胁迫下种胚脂质代谢分析表明,干旱胁迫下脂质代谢物在甘油磷脂代谢通路、甘油酯代谢通路和自噬-其他代谢通路显著富集,且干旱萌发特性好的山农28号种胚脂质代谢能力强于干旱萌发特性差的鑫麦296。对种胚脂肪分解酶类基因、脂质代谢相关nsltp基因及ABA信号基因的表达量检测表明,小麦脂肪分解酶基因、Ta LTPIg.1、MYB96和ABI4基因表达对干旱胁迫的响应规律与小麦品种的干旱萌发特性相关。干旱萌发特性好的山农28号和长6878,干旱萌发12 h脂肪酶3家族蛋白基因、Ta LTPIg.1基因表达显著高于对照;干旱萌发12 h的ABI4基因和24 h的MYB96基因表达显著低于对照。干旱萌发特性差的鑫麦296和新麦38,干旱萌发12 h酰基水解酶基因、48 h的Ta LTPIg.1基因表达显著低于对照;干旱萌发12～24 h的MYB96基因和48 h的ABI4基因表达显著高于对照。综上,萌发期干旱胁迫显著降低了小麦种胚大分子修复能力、抗氧化能力和脂质动员能力,导致种子萌发速度变慢,幼苗健壮度下降。改善吸胀萌动期种胚修复能力和脂质动员能力是提高干旱胁迫下小麦萌发成苗质量的有效途径。

关键词：小麦干旱胁迫萌发成苗特性种胚脂质动员 nsltp