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拟南芥Nbs1基因可变剪切体的功能分析

拟南芥NBS1基因可变剪切体的功能分析

作者：吕春桃昆明理工大学

学位级别：硕士

DNA损伤是影响植物生长发育的一个重要因素,其修复途径主要有同源重组和非同源末端连接两种。Nbs1(Nijmegen breakage syndrome 1)是一个重要的调控因子,通过与MRE11(Meiotic recombination 11)和RAD50相互作用组成MRN复合物参与这两种... 详细信息

DNA损伤是影响植物生长发育的一个重要因素,其修复途径主要有同源重组和非同源末端连接两种。Nbs1(Nijmegen breakage syndrome 1)是一个重要的调控因子,通过与MRE11(Meiotic recombination 11)和RAD50相互作用组成MRN复合物参与这两种损伤修复过程,对维持细胞基因组的完整性具有重要作用。本实验室在前期研究中发现拟南芥中Nbs1基因具有两种可变剪切体,一种是正常剪切的Nbs1基因,另一种是发生了3’端可变剪切(Alternative splicing,AS)的形式,后面通过查阅文献得知该基因已有报道,但是名称和Nbs1一样,在本研究中为了区分二者,就把缺少一段的转录本命名为Nbs1-3。本研究主要对拟南芥的Nbs1和其可变剪切体Nbs1-3在DNA损伤修复中的功能差异进行分析,主要结果如下:1、研究了化学因素DNA损伤剂MMS(Methyl Methanesulfonate)和物理因素UVB(Ultraviolet radiation b)对野生型拟南芥幼苗进行DNA损伤处理对其生长发育和MRN复合物三个组成部分的表达量的影响。同时为了更直观地展示DNA损伤的程度,运用了PI染色液对MMS处理后的根尖细胞进行染色观察。结果表明,本研究中所使用的DNA损伤处理方法是有效的,均能导致拟南芥幼苗的DNA损伤,导致其生长迟缓,并引发其DNA损伤修复反应。MRN复合物组分基因表达量随着MMS处理浓度的增加和UVB照射时间的增加均先升高后降低,并且在MMS处理后,对拟南芥幼苗根尖的PI染色观察到了片状分布的红色区域即受到DNA损伤的死细胞,也能说明拟南芥幼苗根尖细胞受到了DNA损伤。以上结果表明拟南芥幼苗在MMS或者UVB处理后发生了DNA损伤,并通过MRN复合物参与的同源重组或者非同源末端连接途径对发生损伤的DNA进行修复。2、分析Nbs1和Nbs1-3的序列差异,并且初步通过亚细胞定位分析其功能差异。Nbs1-3比Nbs1在第1000与1028 bp之间缺失27 bp,是由于Nbs1-3发生了3’端AS,在剪切第9个内含子的时候连带着把第10个外显子交接处的一段序列一起剪切掉了,所以形成了缺少27 bp的转录本。通过亚细胞定位初步分析二者的功能差异,结果显示Nbs1和Nbs1-3蛋白均定位于细胞核,表明缺少的9个氨基酸并不影响Nbs1蛋白在植物中的表达位置,也不影响MRN复合物组成部分MRE11和RAD50蛋白在植物中的表达位置。这可能是因为第2至124位氨基酸是推测的Nbs1蛋白的核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS),而Nbs1-3比Nbs1缺少了9个氨基酸在第333与343个氨基酸之间,所以缺少这9个氨基酸并不会影响其亚细胞定位。3、通过浸花法获得了10个Nbs1和7个Nbs1-3过表达转基因拟南芥株系,拟南芥Nbs1突变体Nbs1通过三引物法鉴定出了纯合突变体。从Nbs1和Nbs1-3过表达转基因拟南芥株系中分别选取了两个Nbs1表达量较高的株系用0.6 m M MMS进行DNA损伤处理,通过PI染色观察拟南芥幼苗根尖的DNA损伤程度。结果显示Nbs1突变体Nbs1的相对损伤面积最大,Nbs1-3-OE-1的相对损伤面积最小,显著小于WT,表明Nbs1基因在MMS导致的DNA损伤修复中起到了重要的作用,并且在此过程中Nbs1-3可能具有比Nbs1基因更大的作用,即缺少的9个氨基酸可能增强了Nbs1蛋白在DNA损伤修复方面的作用。本研究从探究Nbs1和其可变剪切体Nbs1-3的功能差异出发,通过遗传学和分子生物学方法,研究缺少的9个氨基酸对Nbs1蛋白功能的影响。首先建立了有效的DNA损伤处理以及展示DNA损伤程度的方法,然后对二者的序列进行了分析以及进行了亚细胞定位的观察,但是缺少的9个氨基酸并不影响其蛋白的表达定位。同时将构建的Nbs1和Nbs1-3过表达载体转染野生型拟南芥获得了转基因拟南芥材料,又从拟南芥突变体库Ara Share上购买了拟南芥Nbs1突变体Nbs1,通过前期建立的DNA损伤处理方法对这些拟南芥遗传材料进行处理,通过PI染色观察拟南芥幼苗根尖的染色情况,初步证明了Nbs1基因在拟南芥幼苗的DNA损伤修复方面的重要作用,并推测Nbs1-3可能比Nbs1发挥更大的作用,为研究DNA损伤修复机制提供一定的理论基础。

关键词： DNA损伤修复拟南芥 Nbs1 可变剪切功能分析

SUMOylation stabilizes hSSB1 and enhances the recruitment of Nbs1 to DNA damage sites

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Signal Transduction and Targeted Therapy 2020年第1期5卷 1516-1527页

作者： Liwen Zhou Lisi Zheng Kaishun Hu Xin Wang Ruhua Zhang Yezi Zou Li Zhong Shang Wang Yuanzhong Wu Tiebang Kang Sun Yat-sen University Cancer Center State Key Laboratory of Oncology in South ChinaCollaborative Innovation Center for Cancer MedicineGuangzhou 510060China Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation Medical Research CenterSun Yat-sen Memorial HospitalSun Yat‐sen UniversityGuangzhouChina

Human single-stranded DNA-binding protein 1(hSSB1)is required for the efficient recruitment of the MRN complex to DNA doublestrand breaks and is essential for the maintenance of genome integrity.However,the mechanism by which hSSB1 recruits Nbs1 remains elusive.Here,we determined that hSSB1 undergoes SUMOylation at both K79 and K94 under normal conditions and that this modification is dramatically enhanced in response to DNA damage.SUMOylation of hSSB1,which is specifically fine-tuned by PIAS2α,and SENP2,not only stabilizes the protein but also enhances the recruitment of Nbs1 to DNA damage sites.Cells with defective hSSB1 SUMOylation are sensitive to ionizing radiation,and global inhibition of SUMOylation by either knocking out UBC9 or adding SUMOylation inhibitors significantly enhances the sensitivity of cancer cells to etoposide.Our findings reveal that SUMOylation,as a novel posttranslational modification of hSSB1,is critical for the functions of this protein,indicating that the use of SUMOylation inhibitors(e.g.,2-D08 and ML-792)may be a new strategy that would benefit cancer patients being treated with chemo-or radiotherapy.

关键词： SSB1 damage Nbs1

中国湖南家族性和早发性乳腺癌患者PTEN和Nbs1基因突变检测

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中南大学学报（医学版） 2016年第2期41卷 121-126页

作者：邬玉辉蒋炳涧戴旭胡学丽王守满姜萍岚胡元萍黄隽中南大学湘雅医院乳腺科长沙410008

目的:探讨中国湖南人群家族性和早发性乳腺癌患者磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog,PTEN)和Nijmegen断裂综合征1(Nijmegen breakage syndrome 1,Nbs1)基因的突变特点及潜在意义。方法:纳入131例家族性和早发性... 详细信息

目的:探讨中国湖南人群家族性和早发性乳腺癌患者磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog,PTEN)和Nijmegen断裂综合征1(Nijmegen breakage syndrome 1,Nbs1)基因的突变特点及潜在意义。方法:纳入131例家族性和早发性乳腺癌患者,采用变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)对PTEN基因所有外显子以及Nbs1基因外显子5和外显子6的突变位点进行筛查,然后采用DNA直接测序证实。结果:在131例患者中,有2例发生PTEN基因插入突变IVS4+109ins TCTTA,其突变频率为1.15%;首次发现PTEN基因的2个突变225 A>C(h r 160 Pro)与IVS5+13T>C,另一个已报道的错义突变为rs121909229 G>A(Arg 130 Gln)。在Nbs1基因上发现3个突变,其中IVS6+43A>G与IVS6+127A>G为首次发现,另一个已报道的同义突变为rs1805794G>C(Glu 185 Gln)。结论:新发现的PTEN和Nbs1突变可能是中国湖南人群家族性和早发性乳腺癌的特有突变位点。

关键词：乳腺癌 PTEN Nbs1 突变

Role of Mdm2 and Mdmx in DNA repair

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Journal of Molecular Cell Biology 2017年第1期9卷 69-73页

作者： Christine M. Eischen Department of Cancer Biology Sidney Kimmel Cancer Center Thomas Jefferson University Philadelphia PA 19107 USA

Mdm2 和 Mdmx 是 p53 瘤 suppressor 的批评管理者并且是在许多人的恶意的 overexpressed。在最近的年里，然而，他们染色体不稳定性上的影响被显示是至少，部分地独立于 p53。Mdm2 和 Mdmx 与 Mre11/Rad50/Nbs1 DNA 修理建筑群通过他... 详细信息

Mdm2 和 Mdmx 是 p53 瘤 suppressor 的批评管理者并且是在许多人的恶意的 overexpressed。在最近的年里，然而，他们染色体不稳定性上的影响被显示是至少，部分地独立于 p53。Mdm2 和 Mdmx 与 Mre11/Rad50/Nbs1 DNA 修理建筑群通过他们的协会禁止 DNA 裂缝修理。最近的证据在癌症房间显示那利用 Mdm2 或 DNA 裂缝修理的调停 Mdmx 的抑制能提供一个治疗学的机会，特别地为失去了功能的 p53 的那些恶意。

关键词： Mdm2 Mdmx Nbs1 DNA 修理

大鼠颌下腺放射性损伤修复中SSB1表达变化及其与Nbs1相关性研究

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大鼠颌下腺放射性损伤修复中SSB1表达变化及其与NBS1相关性研究

作者：吕秋丽广西医科大学

学位级别：硕士

目的:研究单链DNA结合蛋白1(single-stranded DNA-binding protein1,SSB1)在大鼠颌下腺(submandibular gland,SMG)组织及上皮细胞放射性损伤修复中mRNA及蛋白表达的变化规律,探讨SSB1与DNA双链断裂(double-strand breaks,DSB)损伤修复的关系;并初步探讨大鼠颌下腺DSB损伤修复中SSB1与Nbs1的变化关系及相互作用。方法:1.SD大鼠Coγ放射性损伤模型建立,用Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)检测大鼠颌下腺组织正常对照组与照射12Gy放射剂量后不同时间点(1、2、3、4、5、6、7、8小时)组中SSB1基因mRNA的表达;用qRT-PCR、免疫印迹(western blot,WB)分别检测鼠颌下腺组织正常对照组与不同放射剂量(3、6、9、12、15Gy)组SSB1mRNA及蛋白表达。2.体外培养SMG上皮细胞,用qRT-PCR检测正常对照组与不同放射剂量(1、2、4、6、8Gy)组大鼠SMG上皮细胞SSB1mRNA的表达;用WB同时检测正常对照组与不同放射剂量(1、2、4、6、8Gy)组大鼠SMG上皮细胞SSB1及Nbs1蛋白表达。3.构建大鼠rAdE5-SSB1-1p2shRNA重组腺病毒,并进一步转染大鼠SMG上皮细胞(rAd-shRNA组),增设空白质粒对照组(rAd-HK组)及空白对照组(control组),通过WB法检测SSB1沉默效果及Nbs1蛋白表达情况。4.进一步使用大鼠rAdE5-SSB1-1p2shRNA重组腺病毒转染SMG上皮细胞,沉默SSB1基因表达后,照射不同放射剂量(0、6Gy)后分为rAd-shRNA、rAd-shRNA+IR组,另设单纯照射6Gy组(Irradiation,IR组)及空白对照组(control组),用WB检测SSB1及Nbs1蛋白表达情况。结果:1.大鼠颌下腺组织经Coγ12Gy放射剂量照射后,随着时间的延长,SSB1mRNA的相对表达量先增高后逐渐减低,于4h组达到高峰,p1 mRNA、蛋白的相对表达量先增高后减低并皆于9Gy放射剂量组达到峰值,p1基因mRNA表达随剂量的增加而增加,在2Gy组达到最高峰,随后逐渐下降;SSB1、Nbs1蛋白表达量皆随着照射剂量的增加先增加后降低,在2Gy组达到高峰;p1、Nbs1蛋白相对表达量均较rAd-HK组、control组显著降低,差异均有统计学意义(均p0.05,差异无统计学意义。4.沉默SMG上皮细胞SSB1基因后,rAd-shRNA+IR组及rAd-shRNA组Nbs1基因蛋白表达量与control组相比皆出现下调,p1、Nbs1蛋白相对表达量较control组高,p1基因mRNA及蛋白表达无剂量依赖性,其表达量随放射剂量的增加先增加后降低;成功沉默大鼠SMG上皮细胞SSB1基因,SSB1沉默可下调Nbs1蛋白表达,二者存在协同关系。在大鼠颌下腺放射性损伤修复中,SSB1可能是DSB修复通路信号启动的钥匙。

关键词： SSB1 放射性损伤 Nbs1 DNA修复颌下腺

干扰Nbs1表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并促进凋亡

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现代肿瘤医学 2021年第11期29卷 1857-1861页

作者：肖瑞雪魏飞力徐忠法甄亚男山东第一医科大学第三附属医院(山东省医学科学院附属医院) 山东济南250031 首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所北京100069

目的:探讨干扰Nbs1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法:应用Lipofectamine 2000 将Nbs1特异性小干扰RNA(si Nbs1)转染至肝癌细胞Hep G2中,以空载脂质体作为对照组。采用RT-PCR及Western blot法检测Nbs1基因表达情况,采用CC... 详细信息

目的:探讨干扰Nbs1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法:应用Lipofectamine 2000 将Nbs1特异性小干扰RNA(si Nbs1)转染至肝癌细胞Hep G2中,以空载脂质体作为对照组。采用RT-PCR及Western blot法检测Nbs1基因表达情况,采用CCK-8法检测转染质粒后si Nbs1对Hep G2细胞增殖能力的影响,采用流式细胞术检测si Nbs1对Hep G2细胞凋亡的影响。结果:不同浓度si Nbs1 (10 nmol/L、20nmol/L、50 nmol/L)均能抑制Hep G2细胞中的Nbs1基因在mRNA水平上的表达(P 1)。最高浓度si Nbs1(50 nmol/L)能抑制NSB1蛋白产物的表达水平(P Nbs1的Hep G2细胞与对照组相比,细胞活力明显减弱(P 1),转染48 h后增殖率下降最为显著;流式细胞检测结果显示,细胞凋亡的比率在转染后明显升高(P 1),并随浓度增加而更为显著。结论:干扰Nbs1基因的表达可以明显抑制Hep G2细胞的增殖,并促进癌细胞凋亡。

关键词： Nbs1 RNA干扰 HepG2细胞细胞增殖细胞凋亡

DNA损伤修复蛋白Nbs1在BPD新生大鼠模型中表达及其作用的研究

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DNA损伤修复蛋白NBS1在BPD新生大鼠模型中表达及其作用的研究

作者：温淑妍中国医科大学

学位级别：硕士

目的:支气管肺发育不良(BPD)作为早产的严重并发症,其病因复杂且预后不良。本研究试图通过研究DNA损伤修复蛋白Nbs1在新生大鼠BPD模型中的动态表达规律,探索其对BPD发生、发展的影响,为阐明BPD氧化应激损伤的病理机制提供理论基础。研... 详细信息

目的:支气管肺发育不良(BPD)作为早产的严重并发症,其病因复杂且预后不良。本研究试图通过研究DNA损伤修复蛋白Nbs1在新生大鼠BPD模型中的动态表达规律,探索其对BPD发生、发展的影响,为阐明BPD氧化应激损伤的病理机制提供理论基础。研究方法:将100只新生SD大鼠在娩出的12小时内随机分配成BPD组(n=50)和对照组(n=50)。BPD组吸入氧浓度(Fi O2)为80%～85%(n=50),对照组吸入空气(Fi O2=21%n=50),两组分别于1、3、7、10、14day收取肺组织标本,分离后纯化、培养肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)。光镜下观察肺组织形态学改变、辐射状肺泡计数(RAC)来评估肺泡发育程度,免疫组化观测Nbs1在肺组织中的定位及表达,细胞免疫荧光观察其在AECⅡ胞核及胞质中的定位;实时荧光定量PCR方法、蛋白质免疫印迹方法来检验Nbs1基因及蛋白表达。结果:与对照组比较,BPD组RAC值从生后7d开始显著降低(P1),10d、14d时进一步下降(P1)。免疫组化可见,Nbs1蛋白主要定位在肺泡上皮细胞的细胞核内,相较于对照组,BPD组随暴露时间延长,浆染色细胞数量增多。细胞免疫荧光进一步验证,Nbs1蛋白在AECⅡ的核质中均有表达,主要定位于细胞核内,对照组相比,BPD组3d开始细胞质染色增强、细胞核染色逐渐减弱(P>0.05),7d、10d时细胞核内表达明显减低(P14d时主要定位于细胞质中(P1)。Nbs1的蛋白表达,对照组各组间无显著差异,与对照组相比,BPD组于生后1d升高并达峰值(P1),继之逐渐下降,3～10d仍比对照组高(P>0.05),14d时低于对照组(PNbs1 m RNA表达水平,对照组之间无显著差异,与对照组相比,BPD组1d时明显升高并达到峰值(P1),继之逐渐下降,3d、7d、10d时低于对照组(P>0.05),14d时明显低于对照组(PNbs1蛋白作为DNA损伤修复的最早识别元件,由于其表达不足及核富集障碍,影响了DNA损伤应答,可能是BPD发生的机制之一。

关键词： Nbs1 DNA损伤支气管肺发育不良新生大鼠

Nbs1基因SNPs与中国汉族人群原发性肝癌的遗传易感性

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生物化学与生物物理进展 2012年第7期39卷 678-686页

作者：黄坚赵艳平李倩张俊霞王岩张蓓首都医科大学附属北京友谊医院实验中心/肝病中心北京100050 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所全国肿瘤防治研究办公室北京100021 天津市传染病医院肝病科天津300192

为分析DNA损伤修复相关基因Nbs1单核苷酸多态性(SNPs)与原发性肝癌遗传易感性的关系,并对高分辨率单链构象多态性(SSCP)检测技术在SNPs分型中的适用性进行评估,本研究对来自中国汉族人群的327例原发性肝癌以及295例阴性对照中Nbs1基因常... 详细信息

为分析DNA损伤修复相关基因Nbs1单核苷酸多态性(SNPs)与原发性肝癌遗传易感性的关系,并对高分辨率单链构象多态性(SSCP)检测技术在SNPs分型中的适用性进行评估,本研究对来自中国汉族人群的327例原发性肝癌以及295例阴性对照中Nbs1基因常见SNPs的稀有等位基因频率进行检测和分析.此外,对Nbs1基因6个常见SNPs分别选择部分样本同时进行直接序列测定,以比较2种方法的检测效果.119例原发性肝癌以及95例肝硬化/慢性肝炎组织标本的SSCP分析结果表明,6个常见Nbs1基因SNPs位点(102G>A,320+208G/A,553G>C,1197T>C,2016A>G和2071-30A>T)中,SNP1197T>C的稀有等位基因频率为68.1%,显著高于肝硬化/慢性肝炎对照的57.9%(P=0.0298).对该SNP位点另外采用208份肝细胞癌和200份健康人群血液标本进一步分析,肝细胞癌SNP 1197T>C的稀有等位基因频率为66.8%,显著高于健康人群对照的58.8%(P=0.0170).其他5个SNPs的稀有等位基因频率在原发性肝癌与肝硬化/慢性肝炎之间均无显著性差异.高分辨率SSCP分析法与直接序列测定法对所选样本的SNPs基因分型结果完全一致,而且直接测序法对PCR扩增产物质量的要求相对高分辨率SSCP分析更高.研究表明,中国汉族人群Nbs1基因SNP 1197T>C可能与原发性肝癌的发生相关,高分辨率SSCP技术准确度与直接测序法相当,且操作更加简便易行,非常适用于大量样本多个已知SNPs的基因分型.

关键词：高分辨率SSCP分析 Nbs1 单核苷酸多态性原发性肝癌遗传易感性

长链非编码RNA Gm15577参与小鼠小脑神经元增殖与分化

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中华病理学杂志 2015年第7期44卷 504-508页

作者：岳永松张伟龙刘春英牛亚梅佟伟民中国医学科学院基础医学研究所神经科学中心北京协和医学院基础学院病理学系 100005 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室

目的鉴定新的参与奈美亨综合征（nbs）小鼠模型中与小脑发育缺陷相关的长链非编码RNA（1ncRNA），并探讨其与小脑增殖分化相关的功能。方法利用芯片技术分析野生型（野生组，nbsl^CNS-ctr）小鼠及Nbs1神经元特异性敲除（突变组，nbsl^CN... 详细信息

目的鉴定新的参与奈美亨综合征（nbs）小鼠模型中与小脑发育缺陷相关的长链非编码RNA（1ncRNA），并探讨其与小脑增殖分化相关的功能。方法利用芯片技术分析野生型（野生组，nbsl^CNS-ctr）小鼠及Nbs1神经元特异性敲除（突变组，nbsl^CNS-ctr）小鼠小脑中RNA的表达差异；利用即时荧光定量PCR技术对芯片结果加以验证；针对目的RNA，检测其全身表达及小脑中表达模式、细胞内定位以及对母基因的表达调控模式。结果IncRNA Gm15577是由神经生长调节因子一1（Negrl）基因内部的内含子区反向转录而成，特异性表达于小脑，且在其发育过程中呈动态变化趋势，而Nbs1缺失之后整体表达水平显著降低；同时，与未分化期比较，分化后的小鼠小脑原代神经前体细胞中Gm15577及其母基因Negrl均有显著升高；Gm15577敲低之后导致Negr1以及小脑增殖分化相关因子Shh与β-catenin在RNA水平的表达显著下调；人髓母细胞瘤临床样本数据分析表明Negr1基因在正常人群与肿瘤患者之间有显著的表达差异。结论从神经特异性敲除Nbs1小鼠模型出发报道了一个新的与小鼠小脑发育相关的IncRNA Gm15577，初步结果表明Gm15577通过调控Negr1进而影响小脑神经元增殖与分化进程中的Shh与β—catenin信号通路，其基因行为异常有可能与髓母细胞瘤发病有一定的相关性。

关键词：小脑 Nbs1 细胞增殖细胞分化长链非编码RNA