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中华神经医学杂志 2015年第9期14卷 905-909页

作者：王寿刚陆玉成黄丽梅尤翠平王龙王富敏苏全平于继徐车峰远泰山医学院泰安271016 临沂市人民医院中心实验室 276003 临沂市人民医院急诊科 276003 临沂市人民医院神经内科 276003 山东省立医院睡眠医学中心济南250021

目的探讨转染hSODl．G93A对NSC-34细胞内铁代谢相关蛋白表达的影响。方法常规体外培养未转染、转染pcDNA3．1（-）、hSODl-pcDNA3．1（-）和hSODl-G93A—pcDNA3．1（-）质粒的NSC-34细胞系；分为正常组、空转组、野生组和突变组。利用... 详细信息

目的探讨转染hSODl．G93A对NSC-34细胞内铁代谢相关蛋白表达的影响。方法常规体外培养未转染、转染pcDNA3．1（-）、hSODl-pcDNA3．1（-）和hSODl-G93A—pcDNA3．1（-）质粒的NSC-34细胞系；分为正常组、空转组、野生组和突变组。利用免疫组化染色法观察各组细胞的形态变化；通过检测丙二醛（MDA）含量观察各组细胞氧化应激水平；用逆转录聚合酶链式反应rRT．PCR）和Westernblotting分别检测各组细胞内铁代谢相关蛋白的基因和蛋白表达水平。结果突变组的细胞胞体变圆，突起减少、变短，细胞内MDA含量明显高于其他3组细胞，差异有统计学意义（P〈0．05）；各组细胞内的转铁蛋白受体（TfR）、二价金属离子转运体1（DMTI）、铁蛋白等基因在基因水平上表达差异无统计学意3L（P〈0．05）；各组细胞内的TfR、DMTl、铁蛋白等在蛋白水平上表达差异无统计学意义（胗O．05），但是突变组细胞铁蛋白表达较正常组细胞明显升高，差异有统计学意义（P，0．051。结论转染hSOD1-G93A对NSC-34细胞（突变组）内TfR、DMTl表达无明显影响．但可以使细胞内铁蛋白在蛋白表达水平明显升高。

关键词：肌萎缩侧索硬化 NSC-34细胞转铁蛋白受体二价金属离子转运体1

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人TDP-43-M337V对NSC-34细胞内ROCK/PTEN信号通路的影响

人TDP-43-M337V对NSC-34细胞内ROCK/PTEN信号通路的影响

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作者：黄丽梅青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨NSC-34细胞转染TDP-43-M337V后对细胞内ROCK/PTEN信号通路的影响。方法1、细胞培养:将空转型、野生型和突变型三株NSC-34细胞系从液氮中分别取出,接种于25 cm2玻璃培养瓶中,置于37℃、5%CO2条件的培养箱内进行复苏、培养和传代... 详细信息

目的探讨NSC-34细胞转染TDP-43-M337V后对细胞内ROCK/PTEN信号通路的影响。方法1、细胞培养:将空转型、野生型和突变型三株NSC-34细胞系从液氮中分别取出,接种于25 cm2玻璃培养瓶中,置于37℃、5%CO2条件的培养箱内进行复苏、培养和传代。2、利用免疫组化方法来观察转染细胞的形态变化;3、细胞氧化损伤的程度通过检测细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量来反应;4、通过MTT检测转染基因对NSC-34细胞活性的影响;5、通过应用Western blots法来检测各组细胞中ROCK/PTEN信号通路下游相关分子在蛋白水平上的表达差异;6、通过ROCK活性检测试剂盒来检测ROCK活性,以观察在该信号通路中ROCK活性的变化。结果1、转染p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V质粒的细胞与转染p DEST30-EGFPTDP-43-wt和p DEST30-EGFP质粒组细胞相比,胞体变圆,突起减少,且轴突变短;经过细胞内MDA含量检测发现,突变的细胞内MDA含量明显高于其它两组细胞(P细胞抑制率显著升高(P细胞中,ROCK1、ROCK2、PTEN、Akt总蛋白表达水平无明显差异(P>0.05);转染p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V组细胞与转染p DEST30-EGFP质粒组细胞相比,p-PTEN的蛋白表达显著增加,而p-Akt的蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P细胞与转染p DEST30-EGFP质粒组细胞相比,pPTEN和p-Akt的蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。3、ROCK活性检测发现,突变的TDP-43-M337V细胞与空转组及野生组细胞相比,ROCK活性无明显变化。结论转染人TDP-43-M337V降低了NSC-34细胞的活性及其抗氧化损伤能力,增加了运动神经元在应激诱导毒性损伤中的易损性。TDP-43-M337V对NSC-34细胞ROCK的活性及其蛋白表达无明显影响,但是可以使PTEN和Akt的磷酸化水平改变,据此我们推测,转染人突变TDP-43基因可能是从不同的机制或通过不同的途径激活了细胞凋亡信号通路,进而诱导细胞凋亡。

关键词：肌萎缩侧索硬化 NSC-34细胞 TDP-43 ROCK/PTEN信号通路

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MafK蛋白及JDP2蛋白在突变型TDP-43转染的NSC-34细胞中的表达及对Nrf2/ARE通路的影响

MafK蛋白及JDP2蛋白在突变型TDP-43转染的NSC-34细胞中的表达及对...

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作者：田亚萍泰山医学院

学位级别：硕士

第一部分稳定表达EGFP-TDP-43蛋白的NSC-34细胞模型构建目的建立稳定表达p DEST30-EGFP-TDP-43蛋白的NSC-34细胞系。方法:构建p DEST30-EGFP、p DEST30-EGFP-TDP-43-WT、p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V三种真核表达载体,应用成熟的转染技术将这三种质粒分别导入到NSC-34细胞中,并用G418试剂筛选出能稳定表达的细胞株。真核细胞中EGFP、EGFP-TDP-43-WT、EGFP-TDP-43-M337V的表达分别用荧光显微镜、RT-PCR、Western blots方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察细胞氧化应激产物MDA的表达情况。结果:成功获得经转染并通过G418反复筛选的p DEST30-EGFP-NSC-34细胞系、p DEST30-EGFP-TDP-43-WT-NSC-34细胞系、p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V-NSC-34细胞系,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达率,约占全部观察细胞的95%以上,RT-PCR及Western blots结果均证实了仅野生组及突变组外源TDP-43在基因水平及蛋白水平的表达,MDA法测定三组细胞内氧化应激中,突变组较空转组及野生组明显升高(PNSC-34细胞经G418筛选,可以成功构建p DEST30-EGFP-TDP-43蛋白稳定表达的细胞系,进而为后续肌萎缩侧索硬化功能实验提供有用的细胞研究模型。第二部分Maf K蛋白及JDP2蛋白在突变型TDP-43转染的NSC-34细胞中的表达及对Nrf2/ARE通路的影响目的探讨在突变型TDP-43转染的NSC-34细胞模型中,Maf K蛋白及JDP2蛋白表达情况,及是否对Nrf2/ARE通路产生影响,为进一步研究ALS的发病机制提供依据。方法1、引入第一部分构建好的ALS细胞模型;引进已获得稳定表达TDP-43的NSC-34细胞株。2、建立三个组。包括空转型、野生型及突变型,分别进行以下操作:1)利用Western blots及电泳技术检测各组细胞中总的Nrf2的变化及下游Ⅱ相解毒酶如NQO1的表达;检测胞浆、胞核内Nrf2表达水平。2)利用丙二醛(MDA)试剂盒检测氧化应激的水平。3)利用免疫组化试剂盒观察细胞形态学变化。4)利用MTT检测试剂盒检测细胞凋亡及细胞活性的变化。3、分别在三个组中检测Mafk蛋白的表达情况。利用Western blots及电泳技术检测Mafk蛋白的表达情况。4、分别在三个组中检测JDP2蛋白的表达情况。利用Western blots及电泳技术检测JDP2蛋白的表达情况。结果1、成功构建稳定表达p DEST30-EGFP、p DEST30-EGFP-TDP-43-WT、p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V三种蛋白的细胞系,分别是空转组、野生组、突变组。2、免疫组化结果示:转染p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V质粒的细胞系细胞胞体变圆,突起减少、变短。3、MDA实验结果示:突变组细胞MDA水平较正常组和野生组明显增高,(P0.05)。4、Western blots结果示:突变组总的Nrf2表达降低,且Nrf2核内积聚,但下游效应因子如NQO1表达却减低,与空转组和野生组比较,差异有统计学意义(P0.05)。6、在Western blots水平,突变组细胞中Maf K表达量明显降低,与空转组及野生组比较,差异有统计学意义(P细胞中JDP2表达量也明显降低,与空转组和野生组比较,差异有统计学意义(PNSC-34细胞模型中,细胞抗氧化应激水平减低,抗氧化能力受损;Nrf2/ARE抗氧化应激通路的下游效应因子表达减少;存在Nrf2表达的核内积聚;参与Nrf2/ARE通路的两个顺式作用元件MAFK及JDP2表达量与正常细胞存在差异,主要表现为是Maf K蛋白及JDP2蛋白表达均减少。抗氧化应激通路产物NQO1的表达量下降可能与这两个蛋白量的变化有关联,具体发病机制还有待进一步研究。

关键词：肌萎缩侧索硬化稳定转染 NSC-34细胞 TDP-43 ALS 抗氧化应激通路 Nrf2/ARE MafK JDP2

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G93A突变的hSOD1基因对Nrf2/ARE信号通路的影响

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中国临床医学 2015年第1期22卷 19-24页

作者：亓法英王富敏于继徐车峰远赵孔波山东省临沂市人民医院神经内科山东临沂276003 山东省临沂市人民医院急救中心山东临沂276003

目的:探讨G93A突变的hSOD1(human Cu/Zn superoxide dismutase)基因在肌萎缩侧索硬化转基因细胞模型NSC-34细胞中对Nrf2/ARE信号通路的影响。方法:将构建好的质粒hSOD1-pcDNA3.1(-)、hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)转染至肌萎缩侧索硬化转基因细胞模型NSC-34细胞内,根据转染质粒的不同分为4组:正常组、空转组、野生组和突变组。通过检测细胞内脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量来判断细胞氧化损伤的程度;检测线粒体膜通透性;通过Western blotting检测细胞中Nrf2、抗氧化酶的蛋白表达水平,以反映Nrf2/ARE信号通路在各组的活化程度。结果:转染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)的NSC-34细胞(突变组)内氧化应激水平增高,同时线粒体通透性增加,提示线粒体受损伤;且Nrf2以及Nrf2/ARE信号通路下游效应分子血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶-1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]的蛋白表达水平均降低(P细胞胞浆中Nrf2表达明显减少(P细胞核中Nrf2增多,突变组细胞更为显著(P细胞Nrf2/ARE信号通路受损,降低了细胞的抗氧化能力,加重了线粒体损伤。

关键词：肌萎缩侧索硬化 NSC-34细胞 Nrf2/ARE通路

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