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丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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生物工程学报 2015年第5期31卷 711-721页

作者：孙涛杨光文张金阳夏雪山昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明650500 云南省分子医学研究中心云南昆明650500

提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ... 详细信息

提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ET-28a载体上,重组载体p ET-28a-ns3转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,以10%SDS-PAGE进行鉴定,获得表达的ns3重组蛋白分子量为72 k Da。将纯化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分离血清进行抗体活性鉴定,小鼠抗体效价为1∶256 000。进一步的Western blotting和间接免疫荧光结果显示,以重组NS3蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体可以很好地识别HCV感染Huh7.5.1细胞中的NS3蛋白,为下一步开展单克隆抗体制备和检测试剂盒研制工作奠定了基础。

关键词：丙型肝炎病毒 B细胞表位 NS3蛋白多克隆抗体

鸭坦布苏病毒NS3蛋白的原核表达及其多克隆抗血清的制备

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四川农业大学学报 2020年第5期38卷 619-623页

作者：林霄贺煜程安春汪铭书贾仁勇朱德康刘马峰杨乔吴英赵新新张沙秋黄娟刘韵雅张玲潘磊昌欧旭敏毛塞陈舜四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心成都611130 四川农业大学动物医学院预防兽医研究所成都611130 动物疾病与人类健康四川省重点实验室成都611130

【目的】利用原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的NS3蛋白,并以此制备鼠抗NS3蛋白的多克隆抗血清。【方法】利用PCR扩增鸭坦布苏病毒CQW1株ns3基因片段,然后将其克隆到pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a(+)-ns... 详细信息

【目的】利用原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的NS3蛋白,并以此制备鼠抗NS3蛋白的多克隆抗血清。【方法】利用PCR扩增鸭坦布苏病毒CQW1株ns3基因片段,然后将其克隆到pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a(+)-ns3。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,筛选获得阳性重组菌,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot试验表明重组NS3蛋白在BL21细胞中成功表达,将重组NS3蛋白切胶纯化后免疫小鼠后收获抗血清。【结果】经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,多克隆抗血清可识别病毒感染细胞过程产生的NS3蛋白和真核表达的NS3蛋白,具有良好的反应性和特异性。【结论】成功制备的DTMUV NS3蛋白的鼠源多克隆血清,将为鸭坦布苏病毒的临床检测和NS3蛋白功能性研究奠定基础。

关键词：鸭坦布苏病毒 NS3蛋白原核表达多抗血清

C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

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安徽农业科学 2023年第18期51卷 115-120页

作者：丁国伟李甜甜徐萍魏荣荣李琛王设市潘晨范娟扬州市扬州优邦生物药品有限公司江苏扬州225008

以经典毒株C株的基因组为模板,测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析,并对抗原表位进行预测,结果表明ns3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物,分别扩增出约645... 详细信息

以经典毒株C株的基因组为模板,测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析,并对抗原表位进行预测,结果表明ns3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物,分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因,分别用pET-28a表达载体进行重组后,获得pET-28a-ns3a、pET-28a-ns3b与pET-28a-ns3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达,b段表达较高,可溶性表达较好,纯化后,可获得重组蛋白CSFV-His-ns3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性,并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强,可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。

关键词： NS3蛋白表达诊断

蓝舌病病毒血清8型NS3蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达与鉴定

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中国兽医杂志 2020年第4期56卷 1-4,10,I0001页

作者：黄超华曹琛福阮周曦史卫军林彦星曾少灵刘建利王潇陈金顶花群义华南农业大学兽医学院广东广州510642 深圳海关动植物检验检疫技术中心广东深圳518045

为表达蓝舌病病毒NS3蛋白,将蓝舌病病毒血清8型ns 3序列克隆至pFastBac-HTA载体上,经转座、转染后获得重组杆状病毒rBac-ns3;用间接免疫荧光(IFA)检测NS3蛋白的表达情况,并采用亲和层析进行纯化;以Western Blot和间接ELISA方法鉴定ns3... 详细信息

为表达蓝舌病病毒NS3蛋白,将蓝舌病病毒血清8型ns 3序列克隆至pFastBac-HTA载体上,经转座、转染后获得重组杆状病毒rBac-ns3;用间接免疫荧光(IFA)检测NS3蛋白的表达情况,并采用亲和层析进行纯化;以Western Blot和间接ELISA方法鉴定NS3蛋白的反应原性。IFA结果显示,重组杆状病毒rBac-ns3感染的Sf9细胞可以大量表达NS3蛋白。Western Blot结果显示,纯化后的NS3蛋白与抗His单抗和绵羊蓝舌病阳性血清能够发生特异性反应;以纯化的NS3蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法可以区分蓝舌病阳性血清和阴性血清,进一步验证本试验利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化出蓝舌病病毒NS3蛋白,表明纯化后的NS3蛋白具有良好的反应原性,可作为开发鉴别诊断试剂盒的备选蛋白及NS3蛋白的结构和生物学功能研究。

关键词：蓝舌病病毒昆虫杆状病毒 NS3蛋白间接ELISA

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白原核表达纯化及多克隆抗体的制备

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动物医学进展 2020年第10期41卷 21-25页

作者：周子恒张哲肖盛中蔡卓轩李岩张彦红杨艳陈创夫盛金良石河子大学动物科技学院新疆石河子832000

原核表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白,并以此免疫动物制备多克隆抗体。对BVDV NS3蛋白的抗原决定簇氨基酸序列分析,构建重组质粒pET30a-ns3,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG诱导目的蛋白表达。选择最优诱导条件对目的... 详细信息

原核表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白,并以此免疫动物制备多克隆抗体。对BVDV NS3蛋白的抗原决定簇氨基酸序列分析,构建重组质粒pET30a-ns3,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG诱导目的蛋白表达。选择最优诱导条件对目的蛋白进行亲和纯化,目的蛋白主要以包涵体形式表达,从而获得NS3蛋白。使用NS3蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗NS3蛋白多克隆抗体,采用ELISA方法检测多克隆抗体效价。结果显示,成功表达并纯化出BVDV NS3蛋白,制备的兔抗NS3蛋白多克隆抗体效价大于1∶128000,为建立BVDV抗体/抗原检测方法及疫苗的研究奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 NS3蛋白表达纯化多克隆抗体

水稻条纹病毒血清学检测体系的建立及其NS3蛋白生物学功能的初步解析

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水稻条纹病毒血清学检测体系的建立及其NS3蛋白生物学功能的初步...

作者：徐红梅扬州大学

学位级别：硕士

水稻条纹病毒（rice stripe virus,RSV）,是纤细病毒属（Tenuivirus）的代表成员。该病毒通过灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）以持久循回增殖的方式进行传播。由RSV引起的水稻条纹叶枯病是水稻生产中重要的病害之一,会造成东... 详细信息

水稻条纹病毒（rice stripe virus,RSV）,是纤细病毒属（Tenuivirus）的代表成员。该病毒通过灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）以持久循回增殖的方式进行传播。由RSV引起的水稻条纹叶枯病是水稻生产中重要的病害之一,会造成东亚地区农业生产上出现严重的经济损失。围绕病毒与植物互作关系网络分子机理开展研究,针对水稻条纹叶枯病的防控措施,建立了 RSV的血清学检测体系。本研究使用原核表达系统表达并纯化了 RSV的nsvc3、ns2和NS3蛋白。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并进行效价评估和后续应用,发现可以用于检测田间带毒的水稻以及携带病毒的灰飞虱。前期研究表明,RSV的NS3蛋白具有沉默抑制子功能,在致病过程中起关键作用。为了解析NS3蛋白的致病机理,本研究通过双分子荧光互补实验（Bimolecular fluorescence complementation,BiFC）在三生烟（Nicotiana sylvestris）中筛选得到两个可能与NS3蛋白互作的候选蛋白,分别为抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase 3,APX3）和光诱导相关蛋白（Light-inducedprotein,LIP）。根据互作蛋白信息,克隆了本生烟中两个候选蛋白对应基因序列的全长编码框序列,命名为NbAPX3和NbLIP。进一步通过酵母双杂交实验（Yeast two-hybrid assay,Y2H）、蛋白质体外结合实验（Pull-down）和免疫共沉淀实验（Co-IP）确定了 NbAPX3和NbLIP能直接与NS3蛋白互作。农杆菌浸润瞬时共表达实验发现NbAPX3和NbLIP与ns3体内的互作会减弱其沉默抑制子的活性。为了明确ns3的候选互作蛋白（NbAPX3和NbLIP）与RSV病毒复制及运动间的关系,本研究选取烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）作为病毒代表,对NbAPX3和NbLIP蛋白的生物学功能进行初步探究。利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）介导的病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）下调NbAPX3及NbLIP的表达,发现能抑制TMV的复制;而过表达NbAPX3蛋白会促进TMV的积累,过表达NbLIP蛋白则会增加TMV的复制。综上所述,NbAPX3和NbLIP蛋白能与NS3蛋白直接互作,且与ns3互作的候选蛋白在代表病毒（TMV）的复制及病毒积累中发挥重要作用,也暗示了其在RSV侵染致病过程中可能发挥着重要作用。关于ns3互作蛋白在RSV的侵染寄主过程中的具体作用机理还需要进一步探究。

关键词： RSV 抗血清 NS3蛋白蛋白互作

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8型蓝舌病病毒NS3蛋白的原核表达及鉴定

黑龙江畜牧兽医 2020年第6期 74-79页

作者：史卫军黄超华曹琛福杨俊兴林彦星王潇花群义深圳海关动植物检验检疫技术中心广东深圳518045 华南农业大学兽医学院广州510642

为了获得可初步鉴别诊断疫苗免疫和自然感染的蓝舌病病毒(BTV)抗原,试验将8型BTV S10基因中NS3蛋白对应的开放阅读框(ORF)克隆到原核低温诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒pCold-ns3,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通... 详细信息

为了获得可初步鉴别诊断疫苗免疫和自然感染的蓝舌病病毒(BTV)抗原,试验将8型BTV S10基因中NS3蛋白对应的开放阅读框(ORF)克隆到原核低温诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒pCold-ns3,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过对IPTG浓度和诱导温度条件优化,确立重组蛋白ns3最佳表达条件,通过镍柱纯化后用Western-blot和间接ELISA鉴定其免疫活性。结果表明:成功构建了pCold-ns3重组质粒,重组菌株在温度为15℃、以1.0 mmol/L IPTG诱导24 h时重组NS3蛋白表达量最高,分子质量约为29 ku;纯化后的重组蛋白能与BTV自然感染阳性血清和His-tag单克隆抗体发生特异性结合。说明成功获得了具有良好反应原性的BTV重组NS3蛋白。

关键词：蓝舌病病毒 NS3蛋白载体构建原核表达鉴定

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选

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中国畜牧兽医 2019年第12期46卷 3475-3485页

作者：何金科杨亚军邓肖玉何延华张超马忠臣王勇陈创夫石河子大学生命科学学院石河子832000 石河子大学动物科技学院石河子832000

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNASta... 详细信息

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNAStar软件预测NS3蛋白的二级结构,为了更准确地预测蛋白质的二级结构,使用SOPMA分析软件进行了二次预测。使用Phyre2在线服务器预测NS3蛋白的三级结构,并用Raswin软件标出各个元素所处的位置。使用4种预测软件(BCPREDS、ABCpred、BepiPred和SVMTriP)分析NS3蛋白的线性B细胞表位,使用NetMHCⅡpan预测CD4+T细胞表位,使用NetBoLApan和IEDB预测CD8+T细胞表位,将所得到的结果进行T细胞和B细胞表位筛选。结果表明,NS3蛋白质由683个氨基酸组成,分子质量为75 ku,理论等电点(pI)为8.31,化学式为C 3347 H 5346 N 916 O 1009 S 28,不稳定系数为35.93,平均亲水性(GRAVY)值为-0.267,表明ns3为稳定性亲水蛋白质。TMHMM结果显示,NS3蛋白不具有跨膜结构域。SOPMA结果表明,在NS3蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别约占30.75%、22.55%、8.35%和38.35%,用DNAStar软件分别标出了α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所处的位置。运用4种不同的B细胞预测软件筛选出8个线性表位:12-16、289-298、349-360、394-407、421-432、489-498、515-525和665-679位氨基酸。用NetMHCⅡpan筛选出4个T细胞表位:248-262、315-320、400-414和482-496位氨基酸。本研究为BVDV NS3蛋白优势抗原的筛选提供了理论依据。

关键词：牛病毒性腹泻病毒(BVDV) NS3蛋白生物信息学分析 B细胞 T细胞表位筛选

PSMB10蛋白与猪瘟病毒NS3蛋白互作及其对猪瘟病毒增殖的影响

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PSMB10蛋白与猪瘟病毒NS3蛋白互作及其对猪瘟病毒增殖的影响

作者：邓少锋华南农业大学

学位级别：硕士

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的重大烈性传染性疾病,对世界各国养猪业造成严重的经济损失。CSFV非结构蛋白ns3在CSFV的增殖过程中发挥了重要作用,但目前有关CSFV ns3蛋... 详细信息

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的重大烈性传染性疾病,对世界各国养猪业造成严重的经济损失。CSFV非结构蛋白ns3在CSFV的增殖过程中发挥了重要作用,但目前有关CSFV NS3蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用关系及互作关系对CSFV增殖的影响机制研究相对较少。为了研究CSFV与宿主细胞的相互作用关系,本实验室前期利用酵母双杂交系统筛选获得8个可能与CSFV NS3蛋白存在相互作用的宿主细胞蛋白,在此基础上,本研究选取与细胞抗病毒感染密切相关的免疫蛋白酶体亚基β10(proteasome subunit beta10,PSMB10)进行进一步的蛋白相互作用功能验证。本研究首先通过共转化酵母试验、免疫共沉淀、GST-pulldown和激光共聚焦试验,确认了宿主细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白之间的相互作用。为了研究CSFV与PSMB10蛋白的相互关系,首先用CSFV感染3D4/2细胞,再对感染后的3D4/2细胞中PSMB10的mRNA和蛋白水平进行检测,研究CSFV感染对细胞蛋白PSMB10表达的影响。结果显示,与未感染细胞相比,CSFV感染的细胞中PSMB10的mRNA和蛋白水平均降低,表明CSFV感染细胞对PSMB10的表达具有抑制作用。为了进一步研究细胞蛋白PSMB10对CSFV增殖的影响,我们将p3×Flag-PSMB10重组质粒转染3D4/2细胞以过表达PSMB10蛋白,将靶向PSMB10基因的shRNA-PSMB10干扰质粒转染3D4/2细胞以抑制PSMB10蛋白的表达,同时分别设立p3×Flag-CMV和shRNA-NC的转染细胞对照,转染后24 h再感染CSFV石门株,qRT-PCR检测CSFV基因拷贝数、IFA测定CSFV的TCID。结果表明,过表达PSMB10蛋白对CSFV的增殖有抑制作用,而在细胞中干扰PSMB10基因表达则促进了CSFV的增殖。在研究了细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白的相互作用及PSMB10蛋白对CSFV增殖影响的基础上,为了进一步探讨细胞蛋白PSMB10对CSFV增殖影响的分子机制,我们将0μg、0.5μg、1μg、2μg的p3×Flag-PSMB10质粒分别与2μg的HA-ns3质粒共转染3D4/2细胞,检测PSMB10蛋白和NS3蛋白的表达情况。结果显示,随着p3×Flag-PSMB10质粒转染量的增加,NS3蛋白的表达量随之下降,表明细胞蛋白PMSB10对CSFV NS3蛋白的表达具有抑制作用。鉴于PSMB10是免疫蛋白酶体的一个亚基并参与泛素-蛋白酶体途径,为了解PSMB10蛋白是否通过泛素-蛋白酶体途径降解NS3蛋白从而对NS3蛋白产生抑制作用,我们再将HA-ns3质粒转染3D4/2细胞,转染后24 h用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,同时设立HA-ns3质粒转染并用DMSO处理的细胞对照,免疫沉淀方法检测NS3蛋白是否被泛素化。结果显示,转染并用MG132处理的细胞能检测到泛素蛋白的表达,而用DMSO处理的转染细胞未见泛素蛋白的表达,表明CSFV NS3蛋白在3D4/2细胞中被泛素化。综上,细胞蛋白PSMB10对NS3蛋白的表达具有抑制作用,其作用可能与泛素-蛋白酶体途径对NS3蛋白的泛素化修饰和降解有关。为了进一步研究PSMB10是否通过MHC-I类抗原递呈途径抑制CSFV的增殖,我们分别检测了CSFV感染、p3×Flag-PSMB10重组质粒转染以及shRNA-PSMB10干扰质粒转染的3D4/2细胞MHC-I类抗原递呈途径转运相关分子TAP(TAP1、TAP2、Tapasin)的mRNA表达水平。结果表明,CSFV感染3D4/2细胞对TAP1、TAP2、Tapasin的mRNA表达有抑制作用,PSMB10对TAP1、TAP2、Tapasin的mRNA表达有促进作用。接着我们将p3×Flag-PSMB10质粒转染3D4/2细胞,24 h后用CSFV石门株感染转染的细胞,分别设立p3×Flag-CMV转染后再感染CSFV的细胞对照和空白细胞对照,Western blot检测TAP1、TAP2、Tapasin蛋白在细胞中的表达情况。结果显示,与p3×Flag-CMV转染后再感染CSFV的细胞对照相比,转染p3×Flag-PSMB10质粒后再感染CSFV的细胞TAP1、TAP2、Tapasin蛋白表达量均显著上升,其中TAP1、TAP2的蛋白表达量超过空白细胞对照,表明CSFV感染3D4/2细胞可抑制TAP1、TAP2、Tapasin蛋白的表达,PSMB10蛋白则可恢复甚至增强CSFV感染的细胞TAP1、TAP2、Tapasin蛋白的表达水平。综上所述,本研究证明了细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白以及CSFV的增殖存在相互作

关键词：猪瘟病毒 NS3蛋白蛋白酶体亚基β10 蛋白互作 MHC-I类抗原递呈