PSMB10蛋白与猪瘟病毒NS3蛋白互作及其对猪瘟病毒增殖的影响

作     者：邓少锋 

作者单位：华南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈金顶

授予年度：2018年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪瘟病毒 NS3蛋白 蛋白酶体亚基β10 蛋白互作 MHC-I类抗原递呈 

摘      要：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的重大烈性传染性疾病,对世界各国养猪业造成严重的经济损失。CSFV非结构蛋白NS3在CSFV的增殖过程中发挥了重要作用,但目前有关CSFV NS3蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用关系及互作关系对CSFV增殖的影响机制研究相对较少。为了研究CSFV与宿主细胞的相互作用关系,本实验室前期利用酵母双杂交系统筛选获得8个可能与CSFV NS3蛋白存在相互作用的宿主细胞蛋白,在此基础上,本研究选取与细胞抗病毒感染密切相关的免疫蛋白酶体亚基β10(proteasome subunit beta10,PSMB10)进行进一步的蛋白相互作用功能验证。本研究首先通过共转化酵母试验、免疫共沉淀、GST-pulldown和激光共聚焦试验,确认了宿主细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白之间的相互作用。为了研究CSFV与PSMB10蛋白的相互关系,首先用CSFV感染3D4/2细胞,再对感染后的3D4/2细胞中PSMB10的mRNA和蛋白水平进行检测,研究CSFV感染对细胞蛋白PSMB10表达的影响。结果显示,与未感染细胞相比,CSFV感染的细胞中PSMB10的mRNA和蛋白水平均降低,表明CSFV感染细胞对PSMB10的表达具有抑制作用。为了进一步研究细胞蛋白PSMB10对CSFV增殖的影响,我们将p3×Flag-PSMB10重组质粒转染3D4/2细胞以过表达PSMB10蛋白,将靶向PSMB10基因的shRNA-PSMB10干扰质粒转染3D4/2细胞以抑制PSMB10蛋白的表达,同时分别设立p3×Flag-CMV和shRNA-NC的转染细胞对照,转染后24 h再感染CSFV石门株,qRT-PCR检测CSFV基因拷贝数、IFA测定CSFV的TCID。结果表明,过表达PSMB10蛋白对CSFV的增殖有抑制作用,而在细胞中干扰PSMB10基因表达则促进了CSFV的增殖。在研究了细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白的相互作用及PSMB10蛋白对CSFV增殖影响的基础上,为了进一步探讨细胞蛋白PSMB10对CSFV增殖影响的分子机制,我们将0μg、0.5μg、1μg、2μg的p3×Flag-PSMB10质粒分别与2μg的HA-NS3质粒共转染3D4/2细胞,检测PSMB10蛋白和NS3蛋白的表达情况。结果显示,随着p3×Flag-PSMB10质粒转染量的增加,NS3蛋白的表达量随之下降,表明细胞蛋白PMSB10对CSFV NS3蛋白的表达具有抑制作用。鉴于PSMB10是免疫蛋白酶体的一个亚基并参与泛素-蛋白酶体途径,为了解PSMB10蛋白是否通过泛素-蛋白酶体途径降解NS3蛋白从而对NS3蛋白产生抑制作用,我们再将HA-NS3质粒转染3D4/2细胞,转染后24 h用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,同时设立HA-NS3质粒转染并用DMSO处理的细胞对照,免疫沉淀方法检测NS3蛋白是否被泛素化。结果显示,转染并用MG132处理的细胞能检测到泛素蛋白的表达,而用DMSO处理的转染细胞未见泛素蛋白的表达,表明CSFV NS3蛋白在3D4/2细胞中被泛素化。综上,细胞蛋白PSMB10对NS3蛋白的表达具有抑制作用,其作用可能与泛素-蛋白酶体途径对NS3蛋白的泛素化修饰和降解有关。为了进一步研究PSMB10是否通过MHC-I类抗原递呈途径抑制CSFV的增殖,我们分别检测了CSFV感染、p3×Flag-PSMB10重组质粒转染以及shRNA-PSMB10干扰质粒转染的3D4/2细胞MHC-I类抗原递呈途径转运相关分子TAP(TAP1、TAP2、Tapasin)的mRNA表达水平。结果表明,CSFV感染3D4/2细胞对TAP1、TAP2、Tapasin的mRNA表达有抑制作用,PSMB10对TAP1、TAP2、Tapasin的mRNA表达有促进作用。接着我们将p3×Flag-PSMB10质粒转染3D4/2细胞,24 h后用CSFV石门株感染转染的细胞,分别设立p3×Flag-CMV转染后再感染CSFV的细胞对照和空白细胞对照,Western blot检测TAP1、TAP2、Tapasin蛋白在细胞中的表达情况。结果显示,与p3×Flag-CMV转染后再感染CSFV的细胞对照相比,转染p3×Flag-PSMB10质粒后再感染CSFV的细胞TAP1、TAP2、Tapasin蛋白表达量均显著上升,其中TAP1、TAP2的蛋白表达量超过空白细胞对照,表明CSFV感染3D4/2细胞可抑制TAP1、TAP2、Tapasin蛋白的表达,PSMB10蛋白则可恢复甚至增强CSFV感染的细胞TAP1、TAP2、Tapasin蛋白的表达水平。综上所述,本研究证明了细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白以及CSFV的增殖存在相互作用关系,为研究宿主细胞抗CSFV的感染机制提供了一定的理论基础。