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中华补血草遗传转化体系的建立及补血草nkcc基因沉默的功能研究

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中华补血草遗传转化体系的建立及补血草NKCC基因沉默的功能研究

作者：张霞山东师范大学

学位级别：硕士

许多环境因子会对植物的生长产生胁迫影响,是植物生长的胁迫因子。植物生长发育过程中不可避免地会受到(环境)胁迫因子的影响。重度的胁迫会对植物的生长发育造成伤害;在农业生产中则会降低农作物的产量、质量和经济效益。研究植物对胁... 详细信息

许多环境因子会对植物的生长产生胁迫影响,是植物生长的胁迫因子。植物生长发育过程中不可避免地会受到(环境)胁迫因子的影响。重度的胁迫会对植物的生长发育造成伤害;在农业生产中则会降低农作物的产量、质量和经济效益。研究植物对胁迫的应答及调控机理对降低胁迫的不利影响,指导农业生产具有积极的意义。高盐是常见的胁迫因子,土壤盐渍化会严重抑制植物的生长和发育,影响农作物的品质和产量。盐对植物造成的胁迫同植物的离子运输密切相关,因此,研究植物的离子运输对理解植物耐盐的机理及调节至关重要。动物中的研究表明,nkcc是一类与盐腺泌盐功能密切相关的离子转运结构,它同Cl---Channel(氯离子通道)以及该基因家族的其它成员的编码产物如KCC、NCC协同配合对动物盐腺的泌盐功能至关重要。在植物中,泌盐是盐生植物耐盐的一种重要策略,但分子水平上对植物泌盐的机理还了解甚少。因此,在植物,特别是在盐生植物中,nkcc的研究对理解植物的泌盐机理,了解动植物中类似基因的功能具有一定的意义。中华补血草(Limonium sinense Kuntze)为白花丹科(plumbagenaceae)补血草属(Limonium)多年生泌盐草本植物。它具有特殊的泌盐结构-盐腺,可将吸收到体内的盐离子排到体外,从而避免盐分胁迫的伤害。中华补血草可以使盐土脱盐,改善土壤结构,被誉为盐碱地改造的"先锋植物"。中华补血草是一种鲜切花栽培种,又是理想的天然干花材料,俗称“星辰花”、勿忘我”,在世界许多地区商业栽培。但中华补血草具有大量的不孕枝,同时又具有同型杂交不孕的特性,种子结实少,限制了专业化生产的发展,可以考虑利用转基因技术来改良补血草品种。通过对补血草盐腺泌盐过程和泌盐机理的研究,盐腺的形态构造及其泌盐过程和规律已有初步了解,但是中华补血草之所以具有较高抗盐能力的关键因子是什么?至今还不太清楚。要研究该问题,基因敲除或RNAi技术无疑是强有力的工具,这就需要建立中华补血草的高效遗传转化体系。本研究是在已建立的中华补血草再生体系的基础上,对农杆菌介导的中华补血草叶圆盘转化体系中各相关影响因子进行了实验研究,研究发现:1)补血草叶片对卡那霉素是敏感的。50mg/L的卡那霉素浓度作为补血草叶片转化受体的筛选浓度比较适宜。2)头孢曲松钠和特美汀的抑菌效果不同。400mg/L的特美汀就能有效抑菌,三到四周转接一次即可,且不影响外植体的分化,既减少了工作量,又提高了转化率。3)接种EHA105菌株时,补血草的转化率远远高于接种LBA4404和GV3101菌株,可达15%。4)对于长至11cm左右的补血草无菌苗叶片,侵染时重悬菌液浓度以OD600=0.7-1.0为宜,转化率可达15%。5)3d和4d共培养天数的处理对补血草转化率的影响不大,以4d的共培养效果稍好,有15%的外植体可以分化出芽。本试验中构建了nkcc基因的沉默载体,并实现了对中华补血草的遗传转化,获得了转基因植株,并得到了分子证据。转基因植株的分子生物学检测如下:1)各转基因株系中,均能通过PCR扩增出nptⅡ基因795bp的特异性条带,初步表明nptⅡ外源基因已整合到受体植物基因组中。2)Southern杂交结果进一步证实外源基因已整合到补血草的基因组中。3)Real time PCR结果显示,随机选取的四个转基因株系的nkcc转录水平会发生不同程度的下降。进一步说明nkcc基因的反向重复片段整合到补血草的基因组后已正常转录,并引起了nkcc RNA的降解。

关键词：中华补血草农杆菌遗传转化 nkcc RNAi

Astrocytic modulation of potassium under seizures

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Neural Regeneration Research 2020年第6期15卷 980-987页

作者： Fushun Wang Xiaoming Qi Jun Zhang Jason HHuang Department of Neurosurgery Baylor Scott&White HealthTempleTXUSA Institute of Brain and Psychological Science Sichuan Normal UniversityChengduSichuan ProvinceChina Department of Neurosurgery PLA General HospitalBeijingChina Department of Surgery Texas A&M University College of MedicineTempleTXUSA

The contribution of an impaired astrocytic K^+ regulation system to epileptic neuronal hyperexcitability has been increasingly recognized in the last decade.A defective K^+ regulation leads to an elevated extracellular K^+ concentration([K^+]o).When[K^+]o reaches peaks of 10-12 mM,it is strongly associated with seizure initiation during hypersynchronous neuronal *** the other hand,reactive astrocytes during a seizure attack restrict influx of K^+ across the membrane both passively and *** addition to decreased K^+ buffering,aberrant Ca^2+ signaling and declined glutamate transport have also been observed in astrogliosis in epileptic specimens,precipitating an increased neuronal discharge and induction of *** review aims to provide an overview of experimental findings that implicated astrocytic modulation of extracellular K^+ in the mechanism of epileptogenesis.

关键词： AQP4 Ca^2+ signaling cell volume connexins epilepsy K^+ buffering mi RNA nkcc pannexin TBI

基于组学对中华绒螯蟹渗透压调节机制的初步研究

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基于组学对中华绒螯蟹渗透压调节机制的初步研究

作者：周俊宇上海海洋大学

学位级别：硕士

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹是我国著名的淡水蟹。它体大、营养丰富、肉质鲜美经济价值极高。中华绒螯蟹主要分布于长江中下游及沿海各省,具有生殖洄游的习性,每年秋冬之交,性成熟的个体沿江洄游到河口入海处的咸淡水交汇... 详细信息

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹是我国著名的淡水蟹。它体大、营养丰富、肉质鲜美经济价值极高。中华绒螯蟹主要分布于长江中下游及沿海各省,具有生殖洄游的习性,每年秋冬之交,性成熟的个体沿江洄游到河口入海处的咸淡水交汇区交配产卵,幼体在咸淡水中发育成幼蟹,然后溯河而上,经过多次蜕壳,成蟹在淡水中生长。中华绒螯蟹在洄游过程中,环境盐度发生了剧烈的变化,环境盐度对中华绒螯蟹的性腺成熟和生殖洄游有重要的影响。中华绒螯蟹能依靠自身特殊的渗透压调节机理适应外界盐度的变化,为更加清楚的认识中华绒螯蟹的渗透压调节,本研究通过运用比较转录组学和比较蛋白质组学技术,初步探究了短期高盐度胁迫下中华绒螯蟹雄性成蟹后鳃组织的基因转录水平表达和蛋白质表达情况,综合分析了高盐度胁迫下中华绒螯蟹后鳃组织中的能量代谢、信息传导、离子转运、免疫应激、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、细胞骨架蛋白等生物学过程;基于转录组学研究,挖掘出与中华绒螯蟹渗透压调节相关的重要离子通道蛋白钠钾氯协同转运蛋白(nkcc),通过基因克隆技术获得nkcc基因的全长,并且分析了其在中华绒螯蟹不同组织、不同盐度以及不同盐度胁迫时间条件下的表达情况。1.急性高盐度胁迫下中华绒螯蟹后鳃的比较转录组学分析为揭示与中华绒螯蟹渗透调节有关的基因和通路,将雄性成蟹(体重=110±5 g)分别在淡水(FW,0 ppt)和海水(SW,25 ppt)中驯化144h。用RNA-Seq技术分析了蟹后鳃转录组的变化,共获得了174903个unigene。通过对FW组和SW组转录基因的比较,共发现932个差异基因,包括433个上调基因和499个下调基因。GO富集分析表明,与盐胁迫相关的一些重要的生物学过程被显著富集,包括能量代谢、离子转运、信号转导和抗氧化活性。KEGG富集分析将差异表达的基因富集到241个特定的代谢途径,其中与能量代谢、氧化磷酸化和三羧酸循环相关的途径被显著富集。高盐度胁迫改变了参与能量代谢、离子转运、信号转导和抗氧化途径的酶的表达,包括柠檬酸合成酶(CS)、Na/K-ATPase(NKA)、nkcc、多巴胺受体D1(DRD1)、突触结合蛋白1(STXBP1)、Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)和谷胱氨酸S-转移酶(GST)。实验所获得的转录组测序数据为中华绒螯蟹新基因的鉴定和生理分析提供了理论基础。2.急性高盐度胁迫下中华绒螯蟹后鳃的比较蛋白质组学分析实验一运用转录组技术比较了中华绒螯蟹在高盐度胁迫的生理条件下鳃细胞内所有mRNA的表达差异。蛋白质是机体行使细胞功能的主要物质承担者,蛋白质组能对特定生理条件下的细胞功能和状态做最直接的描述,因此在实验一的基础上,实验二分析了高盐度胁迫后中华绒螯蟹鳃蛋白质表达的变化情况。运用label free蛋白组技术,共鉴定出了1453个蛋白,在2倍差异倍数(FC)阈值条件下,进行差异蛋白筛选,共鉴定出242个差异蛋白,包括122个上调差异蛋白和120个下调差异蛋白。运用GO数据库和KEGG数据库将差异蛋白进行注释和富集,发现差异蛋白在能量代谢、信号转导、离子转运、肌动蛋白细胞骨架、免疫、脂类代谢、氨基酸代谢等生物学功能中显著富集。结果表明,在经过144h的高盐度胁迫后,中华绒螯蟹能量代谢降低,肌动蛋白和细胞骨架蛋白表达增强。在高盐度胁迫下,中华绒螯蟹通过提高免疫和抗氧化能力来应对高盐度产生的氧化损伤。3.中华绒螯蟹nkcc基因的克隆和表达分析nkcc是运输Na、K和Cl的SLC12家族蛋白,在水生动物离子转运和渗透调节中发挥重要作用。本实验运用RT-PCR和RACE技术从中华绒螯蟹后鳃中克隆了nkcc基因;该基因的cDNA全长为4127bp,其中5’非编码区(UTR)长度为18 bp,3’非编码区长度为944bp,开放阅读框(ORF)长度为3165bp,编码1054个氨基酸。理化分析预测其分子量为51.066 kD,理论等电点为4.65。预测中华绒螯蟹nkcc二级结构由12个跨膜结构域组成,同源对比结果显示,中华绒螯蟹nkcc的氨基酸序列与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)nkcc相似度最高,为86.17%。系统进化分析表明中华绒螯蟹nkcc与拟穴青蟹,三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus),可口美青蟹(Callinectes sapidus),蓝蟹(Callinectes sapidus)聚为一支。运用实时荧光定量(qRT-PCR)对中华绒螯蟹nkcc进行组织定量结果表明,nkcc在中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、胃、心脏、肠、血清、眼柄、胸神经结、脑神经结中均有表达,nkcc在中华绒螯蟹肠的表达量最高。在25盐度急性胁迫时,nkcc在中华绒螯蟹肠中的表达量随着胁迫时间延长变化显著,并在胁迫72h后恢复稳定

关键词：中华绒螯蟹转录组学蛋白质组学渗透压调节鳃基因克隆 nkcc

全营养素-5Fu对胃肠道恶性肿瘤患者围手术期免疫状态的影响

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中国肿瘤临床与康复 2001年第4期8卷 36-38页

作者：马利林沈洪薰陈玉泉徐青朱建伟周广军陈瑞新南通医学院附属医院普外科江苏226001

目的　评价全营养素 - 5Fu治疗对胃肠道恶性肿瘤患者围手术期免疫状态的影响。方法　 78例患者随机分为全营养素 5 Fu组 :给予能全素 5 Fu治疗 ;单纯化疗组 :给予 5 Fu治疗 ;对照组 :围手术期内不予化疗与免疫治疗。三组分别测定围... 详细信息

目的　评价全营养素 - 5Fu治疗对胃肠道恶性肿瘤患者围手术期免疫状态的影响。方法　 78例患者随机分为全营养素 5 Fu组 :给予能全素 5 Fu治疗 ;单纯化疗组 :给予 5 Fu治疗 ;对照组 :围手术期内不予化疗与免疫治疗。三组分别测定围手术期各阶段T细胞亚群与nkcc值。结果　各组治疗前CD3 、CD4 、CD4 /CD8、nkcc值均有明显下降 ,应用全营养素 5 Fu后 ,上述数值均明显升高 ,单纯化疗者则明显下降。结论　全营养素 5 Fu治疗既可抑制肿瘤的生长 ,又可改善患者的营养不良状况与免疫功能。

关键词：全营养素5-Fu T细胞亚群 nkcc 围手术期胃肠道肿瘤治疗

进展期胃肠癌患者围手术期能全素-5Fu的应用及对免疫状态的影响

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中国医师杂志 2001年第1期3卷 22-24页

作者：马利林陈玉泉沈洪薰徐青朱建伟周广军陈瑞新南通医学院附属医院普外科江苏南通226001

目的　研究与评价能全素 - 5Fu治疗对进展期胃肠癌患者围手术期免疫状态的影响并介绍其应用方法。方法　确立免疫指标及正常值 ,将 78例患者随机分为⑴能全素 - 5Fu组 :给予能全素 - 5Fu治疗 ;⑵单纯化疗组 :给予 5-Fu治疗 ;⑶对照组 :... 详细信息

目的　研究与评价能全素 - 5Fu治疗对进展期胃肠癌患者围手术期免疫状态的影响并介绍其应用方法。方法　确立免疫指标及正常值 ,将 78例患者随机分为⑴能全素 - 5Fu组 :给予能全素 - 5Fu治疗 ;⑵单纯化疗组 :给予 5-Fu治疗 ;⑶对照组 :围手术期内不予化疗与免疫治疗。三组分别测定围手术期各阶段T细胞亚群与nkcc值。结果　各组治疗前CD3、CD4 、CD4 /CD8、nkcc值均有明显下降 ,应用能全素 - 5Fu后 ,上述数值均明显升高 ,单纯化疗者则明显下降。结论　能全素 - 5Fu治疗既可抑制肿瘤的生长。

关键词：能全素-5Fu T细胞 nkcc 围手术期消化道肿瘤

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剖腹术和腹腔镜手术与自发性肿瘤转移

国际外科学杂志 1999年第2期30卷 127-127页

作者：李济宇