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nep1-40基因克隆及蛋白的原核表达和纯化

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中国修复重建外科杂志 2006年第1期20卷 9-12页

作者：宫福良王坤正余鹏博党晓谦王春生时志斌杨佩西安交通大学第二医院骨科陕西省疾病控制中心病毒研究室

目的通过基因工程手段从大鼠脊髓中获取Nogo-66、nep1-40基因并实现其蛋白的体外表达。方法从幼年大鼠的脊髓组织中,通过RT-PCR技术获得Nogo-66、nep1-40基因,将目的基因通过基因连接反应与T载体连接,重组质粒进行基因序列测序,构建PQE3... 详细信息

目的通过基因工程手段从大鼠脊髓中获取Nogo-66、nep1-40基因并实现其蛋白的体外表达。方法从幼年大鼠的脊髓组织中,通过RT-PCR技术获得Nogo-66、nep1-40基因,将目的基因通过基因连接反应与T载体连接,重组质粒进行基因序列测序,构建PQE30-GST和目的基因的高表达质粒,异丙基-β-D-硫代半乳糖(isopropy-lthiogalactoside,IPTG)诱导表达,Ni柱纯化,Western-blot法检测纯化的目的蛋白。结果成功获得大鼠Nogo-66、nep1-40基因,加上两端的酶切位点和保护性碱基,大小分别为215bp和137bp。序列测序显示基因突变率为0,表达质粒构建双酶切(BamH和Hind)可见目的基因的条带,经IPTG诱导表达,获得带GST标签的融合蛋白Nogo-66和nep1-40,相对分子质量分别为33.2×103和30.3×103。蛋白纯化结果理想,经Western-blot分析证实抗原性正确。结论Nogo-66、nep1-40蛋白可通过基因工程手段获得体外高效表达,这将对其功能的研究及脊髓损伤疫苗的研究提供基础。

关键词： nep1-40 蛋白表达脊髓损伤

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nep1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

中国修复重建外科杂志 2012年第2期26卷 177-181页

作者：袁海峰宋跃明刘浩周春光孔清泉刘立岷龚全四川大学华西医院骨科成都610041 宁夏医科大学附属总医院脊柱骨科

目的构建nep1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有nep1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取nep1-40基因编码区片段。将目的基因... 详细信息

目的构建nep1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有nep1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取nep1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测nep1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取nep1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示nep1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建nep140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨nep1-40基因功能奠定了实验基础。

关键词： nep1-40 神经再生慢病毒载体 293T细胞

nep1-40对视网膜缺血-再灌注损伤过程中视网膜细胞的保护作用

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中华实验眼科杂志 2014年第3期32卷 220-225页

作者：刘索新鞠学红于树娜王浩潍坊医学院解剖学教研室 261053

背景视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）可导致细胞凋亡,凋亡是一个复杂的过程,与许多基因有关,探讨药物对RIRI后视细胞凋亡的保护作用具有重要意义. 目的探讨Nogo-A在大鼠RIRI模型中的表达及其与细胞凋亡的关系,研究Nogo受体竞争性拮抗剂... 详细信息

背景视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）可导致细胞凋亡,凋亡是一个复杂的过程,与许多基因有关,探讨药物对RIRI后视细胞凋亡的保护作用具有重要意义. 目的探讨Nogo-A在大鼠RIRI模型中的表达及其与细胞凋亡的关系,研究Nogo受体竞争性拮抗剂nep1-40对视网膜细胞的保护作用. 方法将78只SD大鼠按随机数字表法随机分为正常组、RIRI组和nep1-40组,RIRI组及nep1-40组大鼠分别用前房升高眼压的方法升高眼压至大鼠视网膜苍白,持续60 min,然后恢复眼压至视网膜色泽恢复,制作RIRI大鼠模型.术后6h、12 h及1、2、3、7d用过量的水合氯醛处死大鼠,制备视网膜标本.透射电子显微镜下观察各时间点各组大鼠视网膜的超微结构,采用TUNEL法检测视网膜细胞的凋亡情况,并计算细胞凋亡指数（AI）.采用免疫组织化学法检测视网膜组织中Nogo-A蛋白的表达,并采用逆转录PCR（RT-PCR）法半定量检测Nogo-A mRNA在视网膜中的表达. 结果正常组大鼠视网膜各层结构正常；RIRI组大鼠视网膜再灌注12h后可见少量视网膜细胞器的线粒体嵴异常及空泡化,再灌注后1 ～2d可见凋亡小体；nep1-40组视网膜的视细胞外节膜盘略疏松,部分线粒体嵴短小,空泡化,未见凋亡小体,视网膜细胞超微结构损害明显轻于RIRI组.TUNEL检测显示细胞凋亡出现于再灌注后6h,并逐渐递增,再灌注后1d凋亡细胞数目达高峰,2d后开始下降,但再灌注后3d仍可见TUNEL阳性细胞.nep1-40组各时间点间凋亡细胞数目较RIRI组明显减少.正常组、RIRI组和nep1-40组大鼠在不同时间点细胞AI的差异均有统计学意义（F分组=100.850,P=0.000;F时间=34.309,P=0.000）,其中RIRI组和nep1-40组大鼠视网膜细胞AI明显高于正常组,而nep1-40组AI明显低于RIRI组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.Nogo-A蛋白及其mRNA主要表达于RIRI后的视网膜,再灌注后6h大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA均开始增加,至再灌注id时表达达高峰,然后逐渐减弱,但再灌注后7d仍有表达.3个组大鼠不同时间点视网膜中Nogo-A蛋白的表达差异有统计学意义（F分组=164.139,P=0.000; F时间=21.772,P=0.000）,Nogo-A mRNA的表达差异有统计学意义（F分组=93.889,P=0.000;F时间=6.349,P=0.000）,nep 1-40组和RIRI组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA的表达均明显高于正常组,而nep1-40组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA在各时间点的表达均低于RIRI组,差异均有统计学意义（P＜0.05）. 结论 Nogo-A可促进RIRI后视网膜细胞的凋亡,nep1-40能抑制Nogo-A的表达,从而减少视网膜细胞的凋亡,对RIRI后的视网膜细胞有保护作用.

关键词： nep1-40 视网膜缺血-再灌注损伤 Nogo-A 凋亡

慢病毒介导nep1-40及NT-3双基因转染神经干细胞的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2018年第4期32卷 420-427页

作者：王林楠汪雷宋跃明刘立岷杨曦丰干均周春光四川大学华西医院骨科成都610041

目的通过慢病毒载体将nep1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子_3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSC_s)内进行表达,探讨nep1-40及NT-3双基因转染NSC_s的可行性,为NSC_s体内实验奠定基础。方法将SD大鼠胚胎室管膜区NSC_s采用空载慢病毒载体(A组)、nep1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及nep1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组)。用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间。再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中nep1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中nep1-40及NT-3蛋白的表达。结果荧光显微镜观察示,MOI为10时nep1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSC_s内转染率最高,最佳时间为转染48 h时。实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组nep1-40 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P0.05)。C、D组NT-3 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P0.05)。结论通过慢病毒载体可将nep1-40及NT-3双基因成功转染入NSC_s内,在NSC_s内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用。

关键词：神经干细胞 nep1-40 神经营养因子3 慢病毒载体转染

nep1-40治疗增加大鼠脊髓损伤引起的降钙素基因相关肽CGRP的表达

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免疫学杂志 2013年第8期29卷 654-658页

作者：徐纪伟孙丹华漯河医学高等专科学校基础医学部 462002

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord impairment,SCI)后Nogo受体拮抗剂nep1-40对降钙素基因相关肽(calcitoningene related peptide,CGRP)表达的影响。方法取雌性SD大鼠,随机分成对照组、生理盐水组和nep1-40治疗组,每组60只。生理盐水组... 详细信息

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord impairment,SCI)后Nogo受体拮抗剂nep1-40对降钙素基因相关肽(calcitoningene related peptide,CGRP)表达的影响。方法取雌性SD大鼠,随机分成对照组、生理盐水组和nep1-40治疗组,每组60只。生理盐水组和nep1-40治疗组的大鼠建立脊髓半切损伤模型,并在蛛网膜下腔留管,再分别注射生理盐水和nep1-40;对照组的大鼠不损伤脊髓。SCI后1、3、7、14、21 d收集损伤部位的脊髓组织,再用免疫荧光、免疫印迹检测每组CGRP蛋白含量,并在术后7 d采用免疫荧光双标技术检测损伤部位的脊髓内生长相关蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)、CGRP的表达量。结果生理盐水组CGRP阳性神经细胞减少,而nep1-40组CGRP阳性神经细胞24 h内减少,然后开始增多,到术后7 d达到高峰,之后一直维持在高水平表达,而对照组发现CGRP阳性神经细胞在低水平表达。免疫印迹和免疫荧光的结果一致。术后7 d,nep1-40组GAP-43阳性神经细胞数最多,生理盐水组次之,对照组未发现,而且发现GAP-43和CGRP有共表达。结论脊髓损伤后,nep1-40可以降低神经细胞Nogo-A的表达而大量增加CGRP、GAP-43的表达,从而改善脊髓的内环境,促进神经突起的修复。

关键词：脊髓损伤 nep1-40 降钙素基因相关肽

nep1-40对成年单眼剥夺弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用

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国际眼科杂志 2013年第2期13卷 246-251页

作者：罗瑜琳吴小影刘双珍陶利娟湖南省儿童医院眼科中国湖南省长沙市410007 中南大学湘雅医院眼科中国湖南省长沙市410008

目的:探讨nep1-40对成年单眼剥夺弱视大鼠视皮层结构及功能可塑性的再激活作用及意义。方法:60只新生SD大鼠随机分为6组:正常对照组(Nor)、正常+PBS治疗组(Nor+PBS)、正常+nep1-40治疗组(Nor+nep)、模型对照组(MD)、模型+PBS治疗组(MD+P... 详细信息

目的:探讨nep1-40对成年单眼剥夺弱视大鼠视皮层结构及功能可塑性的再激活作用及意义。方法:60只新生SD大鼠随机分为6组:正常对照组(Nor)、正常+PBS治疗组(Nor+PBS)、正常+nep1-40治疗组(Nor+nep)、模型对照组(MD)、模型+PBS治疗组(MD+PBS)及模型+nep1-40治疗组(MD+nep)。模型组大鼠于出生后21d缝合右侧眼睑建立单眼剥夺弱视模型,于45日龄时打开剥夺眼,对各组大鼠行闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测,确定单眼剥夺模型建立成功后,对需给药的各组大鼠按组别给予nep1-40或PBS侧脑室注药治疗7d。于52日龄时对各组大鼠再次行F-VEP检测后处死动物,取左侧视皮层进行透射电镜观察突触超微结构变化。结果:45日龄时F-VEP检测示,MD组、MD+PBS组及MD+nep组与Nor组比较,P波潜伏期延长,波幅降低(Pnep组与MD组、MD+PBS组大鼠比较,右眼F-VEP的P波潜伏期及波幅差异有统计学意义(P0.05);MD+PBS组与MD组大鼠比较,右眼F-VEP的P波潜伏期及波幅差异无统计学意义(P>0.05),而与Nor组比较差异有统计学意义(Pnep组大鼠剥夺眼对侧视皮层神经元突触界面结构参数的各项指标均较MD组、MD+PBS组明显改善(P0.05)。MD+PBS组与MD组大鼠比较剥夺眼对侧视皮层神经元突触界面结构参数的各项指标差异均无统计学意义(P>0.05),而与Nor组比较差异有统计学意义(Pnep1-40可使成年单眼剥夺弱视大鼠剥夺眼对侧视皮层神经元的突触界面结构参数得以恢复,F-VEP的P波潜伏期及波幅恢复至正常水平,重新"激活"被抑制的视皮层结构及功能可塑性,为成年弱视患者提供新的治疗途径奠定了理论基础。

关键词： nep1-40 单眼剥夺视皮层可塑性闪光视觉诱发电位

nep1-40促进高苯丙氨酸损伤大鼠神经元Nogo A表达

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基础医学与临床 2011年第3期31卷 259-262页

作者：黄成姣黄丽素张拥军叶军李端顾学范上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所内分泌遗传代谢组上海200092 湖北省妇幼保健院儿内科

目的了解神经元NgR受体拮抗剂nep1-40对高苯丙氨酸（Phe）作用下大鼠大脑皮质层神经元Nogo A蛋白表达的影响。方法原代培养胎龄16~18 d的SD大鼠皮质神经元,体外模拟高Phe（0.9 mmol/L）环境,并用不同浓度nep1-40干预;用免疫荧光方法检... 详细信息

目的了解神经元NgR受体拮抗剂nep1-40对高苯丙氨酸（Phe）作用下大鼠大脑皮质层神经元Nogo A蛋白表达的影响。方法原代培养胎龄16~18 d的SD大鼠皮质神经元,体外模拟高Phe（0.9 mmol/L）环境,并用不同浓度nep1-40干预;用免疫荧光方法检测神经元轴突生长和生长锥塌陷情况,实时荧光定量PCR和Western blot检测Nogo AmRNA和蛋白表达。结果 Nogo A可以在神经元胞体和突起表达;高Phe作用12、24和48 h神经元NogoAmRNA与α微管蛋白（α-Tub）的相对表达量明显减低（P〈0.05）;高Phe作用后神经元Nogo A蛋白明显降低（P〈0.05）;nep1-40对正常神经元无促进作用,但对高phe作用下的神经元呈浓度依赖性地促进其Nogo A的表达。结论 nep1-40可以促进高Phe损伤时神经元Nogo A的表达增高,从而促进神经元轴突的生长。

关键词：高苯丙氨酸神经元 Nogo A nep1-40

nep1-40基因工程神经干细胞修复脊髓损伤的机制研究

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NEP1-40基因工程神经干细胞修复脊髓损伤的机制研究

作者：张弼宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的1.构建nep1-40基因工程神经干细胞(Neural stem cell,NSC),探究其自身分化的潜能以及对成熟神经元轴突生长的调节作用;2.通过检测nep1-40过表达对Rho A/ROCK信号转导通路下游关键调控因子的影响,明确nep1-40-NSCs促进轴突再生的机制... 详细信息

目的1.构建nep1-40基因工程神经干细胞(Neural stem cell,NSC),探究其自身分化的潜能以及对成熟神经元轴突生长的调节作用;2.通过检测nep1-40过表达对Rho A/ROCK信号转导通路下游关键调控因子的影响,明确nep1-40-NSCs促进轴突再生的机制,为脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)的治疗提供理论依据。方法***1-40基因过表达载体的构建:检索已知大鼠的nep1-40基因序列,合成引物,通过PCR方法扩增nep1-40基因;将扩增的nep1-40基因与酶切线性化的载体pc DNA3.1(+)进行定向连接后转化*** DH 5α感受态细胞;利用PCR技术对长出的克隆先进行菌落鉴定,然后对PCR鉴定结果为阳性的克隆进行双酶切鉴定及测序验证;将构建成功的质粒转染原代神经干细胞,分别采用RT-PCR、Western Blot和ELISA方法检测nep1-40在转录、翻译水平及细胞外的表达情况。***1-40-NSCs的培养、分化及鉴定:提取孕20天SD大鼠的胎鼠原代神经干细胞并采用悬浮培养技术进行培养、传代,应用免疫荧光染色方法行Nestin鉴定;并用不同分化培养基诱导其贴壁分化,行Tuj-1、GFAP、Oligo2及MBP免疫荧光染色对其分化潜能进行鉴定,在免疫荧光显微镜下观察染色结果,同时采用RT-PCR、Western Blot实验方法检测Tuj-1、GFAP、Oligo2及MBP在转录和翻译水平的表达。***1-40-NSCs与大鼠海马组织神经元共培养:实验设计nep1-40-NSCs为实验组,NSCs组为对照组,以1n M浓度Nogo-66干预,共培养5天后行β-tubulinⅢ免疫荧光染色检测,测量各组大鼠海马组织神经元轴突新增面积,Phalloidine染色观察生长锥及丝状伪足结构;采用Western Blot方法检测轴突及树突再生的标记物如生长相关蛋白43(Growth-associated protein 43,GAP-43)、微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein 2,MAP-2)、淀粉样蛋白βA4(AmyloidβA4,APP)的相对表达量;对Rho A/ROCK信号转导通路下游多种调控生长锥的蛋白质底物包括LIMK1,LIMK2,Cofilin以及MLCⅡ在蛋白质水平、磷酸化程度方面进行检测。结果1.经测序和双酶切验证成功构建nep1-40基因过表达载体,转染NSC后检测nep1-40在转录和翻译水平的表达量及细胞培养液中的nep1-40表达量,nep1-40-NSCs组均显著高于对照组,差异具有统计学意义(Pnep1-40-NSCs组Tuj-1、Oligo2及MBP所标记的阳性细胞数明显高于对照组(P1-40-NSCs与大鼠海马组织神经元共培养发现nep1-40-NSCs组的轴突新增面积明显大于NSCs组,差异具有统计学意义(Pnep1-40-NSCs组的生长锥面积增宽,伪足数量增多且长度增加(Pnep1-40-NSCs组GAP-43、MAP-2蛋白相对表达量上调,而APP蛋白相对表达量下调(P1,LIMK2,Cofilin和MLCⅡ的磷酸化程度均明显降低,差异具有统计学意义(P1.本研究成功构建nep1-40基因工程NSCs,在转录和翻译水平以及细胞外均检测到nep1-40因子的大量表达。***1-40-NSCs在体外能够诱导分化为神经元和神经胶质细胞,并显著提高大鼠海马神经元细胞的存活率。***1-40-NSCs能够克服Nogo-66的抑制作用,促进与其共培养的海马组织神经元轴突的延长,影响生长锥的结构发育,并且其作用机制可能是通过调控LIM激酶,Cofilin和MLCⅡ的磷酸化水平实现促进轴突生长从而实现修复脊髓损伤的效果。

关键词：脊髓损伤 nep1-40 神经干细胞基因工程

nep1-40和NT-3基因共转染雪旺细胞来源的外泌体对神经干细胞作用的实验研究

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NEP1-40和NT-3基因共转染雪旺细胞来源的外泌体对神经干细胞作用...

作者：邓志鹏四川大学

学位级别：硕士

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重危害人类健康的临床常见创伤性疾病,常造成永久性截瘫或四肢瘫。然而目前临床治疗手段非常有限,常规的药物、手术减压等治疗效果不佳,难以从根本上恢复已经受损的脊髓功能,故SCI后脊髓神经... 详细信息

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重危害人类健康的临床常见创伤性疾病,常造成永久性截瘫或四肢瘫。然而目前临床治疗手段非常有限,常规的药物、手术减压等治疗效果不佳,难以从根本上恢复已经受损的脊髓功能,故SCI后脊髓神经功能的再生修复已成为全球共同关注的重大课题。在基础研究领域,神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)移植于脊髓患处可有效地促进其神经功能的恢复,因此NSCs治疗SCI具有广阔的临床治疗前景。但移植后的NSCs存活率低、分化率低、轴突生长效率低成为其主要治疗障碍。如何弥补其治疗缺陷,被认为可能将提高干细胞治疗效率,具有重大的基础与临床转化意义,为SCI后神经功能恢复提供极大的希望。雪旺细胞(Sch-wann cells,SCs)来源的外泌体(Schwann cells Derived Exosomes,SCDEs)可参与神经保护、轴突发芽和轴突/髓鞘再生。Nogo外细胞肽残基1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40,nep1-40)是Nogo蛋白受体(Nogo receptor,Ng R)的竞争性拮抗剂,可阻断Nogo蛋白或中枢髓鞘相关蛋白通过结合Ng R触发对轴突生长的抑制作用。神经营养因子-3(neurotrophin 3,NT-3)属于神经生长因子家族,编码外周和中枢神经系统神经元的营养蛋白,可促进NS-Cs的存活和分化。本研究通过慢病毒载体将nep1-40及NT-3双基因转染SCs,提取其外泌体并进行鉴定,发现外泌体中nep1-40与NT-3蛋白含量明显增高,说明外泌体能够有效地运载目的基因蛋白产物。然后将SCDEs与NSCs共培养后,CCK-8检测细胞活性,发现在NT-3蛋白存在时细胞活性明显增高。免疫荧光检测神经元特异核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)与胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)阳性的细胞数,nep1-40+NT-3-SCDEs组中NeuN阳性细胞数最多,而GFAP阳性细胞数最少,同时NeuN与GFAP阳性细胞百分比进行了比较,组间差异具有统计学意义,说明nep1-40+NT-3-SCDEs可高效地促进NSCs的存活与分化。最后,通过proBDNF建立体外轴突损伤模型,将外泌体与神经元培养,免疫荧光检测神经元细胞骨架蛋白F-actin的表达,发现nep1-40+NT-3-SCDEs组中Factin荧光强度最高,神经突/轴突形态清晰可见;同时经测量各组轴突长度并进行统计分析,发现nep1-40+NT-3-SCDEs处理后,轴突生长情况接近对照组,说明nep1-40+NT-3-SCDEs可高效地促进轴突的生长。为了解决单纯NSCs移植的缺陷,本实验从外泌体结合基因工程角度,进行了新方法的探索与研究。在体外实验中证实nep1-40及NT-3双基因共转染雪旺细胞来源的外泌体可促进NSCs的存活与分化,神经突/轴突的生长,这种新的调控方法,可能有效解决NSCs移植后低存活率、低分化效率、轴突生长效率低的治疗缺陷,为SCDEs与NSCs共移植的体内实验奠定基础,为SCI的治疗提供新的思路和理论依据。第一章nep1-40和NT-3基因共转染雪旺细胞外泌体的提取鉴定目的:探究能否通过基因编辑技术增加雪旺细胞外泌体中目的因子nep1-40及NT-3的含量。材料和方法:取对数生长期的大鼠雪旺细胞(RSC96细胞),使用含有nep1-40和NT-3病毒液分步转染细胞完成双基因修饰,q RT-q PCR检测细胞中mRNA含量,Western blot检测细胞中蛋白含量。利用超速离心法提取细胞上清液中的外泌体,纳米粒子追踪分析技术(NTA)检测分离的外泌体直径分布、TEM电镜观察外泌体形态,BCA法及Western-blot检测外泌体中蛋白的含量。结果:使用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10的nep1-40和NT-3病毒液转染后荧光强度随着时间而增强,48h时荧光信号相对较高且细胞状态较好。与空载质粒组即RSC96组相比,q RT-PCR检测提示RSC96-nep1-40+NT-3组细胞中nep1-40与NT-3基因mRNA表达明显上调(P1);Western blot检测提示nep1-40和NT-3蛋白在RSC96-nep1-40+NT-3组细胞及培养基中的含量显著增高(P1)。BCA标准品建立的标准曲线的回归方程为y=0.4665x+0.0623(y;OD值;x;样本浓度mg/m L),经计算可得RSC96组外泌体中蛋白浓度为0.944 mg/m L,而RSC96-nep1-40+NT-3组外

关键词：外泌体雪旺细胞 nep1-40 NT-3 神经干细胞慢病毒分化轴突