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Live cell imaging and proteomic profiling of endogenous NEAT1 lncRNA by CRISPR/ Cas9-mediated knock-in

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Protein & Cell 2020年第9期11卷 641-660页

作者： Bohong Chen Shengcheng Deng Tianyu Ge Miaoman Ye Jianping Yu Song Lin Wenbin Ma Zhou Songyang Sun Yat-sen Memorial Hospital Sun Yat-sen UniversityMOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation and Guangzhou Key Laboratory of Healthy Aging ResearchSYSU-BCM Joint Research CenterSchool of Life SciencesSun Yat-sen UniversityGuangzhou 510275China State Key Laboratory of Ophthalmology Zhongshan Ophthalmic CenterSun Yat-sen UniversityGuangzhou 510060China Marrs Mclean Department of Biochemistry and Molecular Biology Baylor College of MedicineOne Baylor PlazaHoustonTX 77030USA

In mammalian cells,long noncoding RNAs(lncRNAs)form complexes with proteins to execute various biological functions such as gene transcription,RNA processing and other signaling activities.However,methods to track endogenous lncRNA dynamics in live cells and screen for lncRNA interacting proteins are limited.Here,we report the development of CERTIS(CRISPR-mediated Endogenous lncRNA Tracking and Immunoprecipitation System)to visualize and isolate endogenous lncRNA,by precisely inserting a 24-repeat MS2 tag into the distal end of lncRNA locus through the CRISPR7Cas9 technology.In this study,we show that CERTIS effectively labeled the paraspeckle lncRNA NEAT1 without disturbing its physiological properties and could monitor the endogenous expression variation of NEAT1.In addition,CERTIS displayed superior performance on both short-and long-term tracking of NEAT1 dynamics in live cells.We found that NEAT1 and paraspeckles were sensitive to topoisomerase I specific inhibitors.Moreover,RNA Immunoprecipitation(RIP)of the MS2-tagged NEAT1 lncRNA successfully revealed several new protein components of paraspeckle.Our results support CERTIS as a tool suitable to track both spatial and temporal lncRNA regulation in live cells as well as study the lncRNA-protein interactomes.

关键词： CRISPR/Cas9 genome editing endogenous lncRNA labeling MS2-MCP NEAT1 paraspeckle dynamics

长链非编码RNA NEAT1通过调控IL-8参与肠上皮细胞抗隐孢子虫反应

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第4期40卷 487-492页

作者：李腾沈玉娟崔丽君刘华胡媛姜岩岩曹建平中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织热带病合作中心国家级热带病国际研究中心上海200025

目的探索长链非编码RNA NEAT1(lncRNA NEAT1)在调控宿主细胞抗隐孢子虫免疫反应的作用及其初步机制。方法采用微小隐孢子虫感染人结直肠癌细胞系HCT-8细胞(卵囊∶细胞比例为2∶1),构建微小隐孢子虫感染肠上皮细胞模型。分别于感染后4 h... 详细信息

目的探索长链非编码RNA NEAT1(lncRNA NEAT1)在调控宿主细胞抗隐孢子虫免疫反应的作用及其初步机制。方法采用微小隐孢子虫感染人结直肠癌细胞系HCT-8细胞(卵囊∶细胞比例为2∶1),构建微小隐孢子虫感染肠上皮细胞模型。分别于感染后4 h和36 h观察感染组及未感染对照组的HCT-8细胞生长情况;提取各组细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测炎性细胞因子白细胞介素-8(IL-8)的基因表达水平,并动态检测lncRNA NEAT1及其长转录本lncRNA NEAT1_2的表达。同时利用lncRNA NEAT1抑制剂Smart Silencer体系建立lncRNA NEAT1敲减的细胞模型(lncRNA NEAT1KD),比较其与未敲减对照组细胞IL-8 mRNA的表达水平。结果微小隐孢子虫卵囊与HCT-8细胞共孵育4 h后,子孢子贴附并入侵细胞,感染组lncRNA NEAT1和lncRNA NEAT1_2的相对表达量分别为0.467±0.364和0.282±0.230,较对照组(0.960±0.152和0.865±0.219)降低(t=2.780、3.672,P1.273±0.647,与对照组(1.017±0.231)差异无统计学意义(t=0.828,P>0.05);感染后36 h,隐孢子虫成功侵入宿主细胞并繁殖,感染组细胞lncRNA NEAT1及lncRNA NEAT1_2相对表达量分别为2.728±0.897和3.303±2.643,较对照组(1.029±0.237和1.000±0.449)均上调(t=4.854,P1;t=2.577,P1.046±0.293)上调(t=5.652,P1)。lncRNA NEAT1KD组lncRNA NEAT1及lncRNA NEAT1_2的相对表达量分别为0.382±0.126和0.312±0.068,较对照组(1.040±0.446和1.005±0.410)下调(t=4.481,P1;t=5.301,P1)。LncRNA NEAT1^(KD)组IL-8 mRNA相对表达量为0.525±0.230,低于对照组(0.959±0.229)(t=4.688,P1)。结论随着微小隐孢子虫感染进程,感染细胞lncRNA NEAT1的表达动态上调,并通过调控细胞因子IL-8的转录,参与宿主细胞抗微小隐孢子虫免疫应答。

关键词：微小隐孢子虫长链非编码RNA lncRNA NEAT1 IL-8 宿主免疫

下调lncRNA NEAT1通过NF-κB信号传导途径抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放

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中国免疫学杂志 2023年第7期39卷 1409-1414页

作者：邱光钰曹锋生黄敏黄远东唐丹丹湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院急诊重症医学科襄阳441021 湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院呼吸内科襄阳441021

目的:探究下调lncRNA NEAT1对TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放的影响。方法:将肺泡上皮细胞A549分成Control组、TNF-α组(TNF-α处理)、sh-NC组(转染shRNA control,TNF-α处理)、sh-NEAT1组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α处理)、sh-NEAT1+PMA组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α和NF-κB信号激活剂PMA处理)。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD活性,CellROX Green法检测细胞中ROS水平,ELISA检测IL-6、IL-8、IL-1β水平,Western blot检测Cleaved caspase-3、p65蛋白表达。结果:与Control组相比,TNF-α组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,MDA含量、ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β增多,细胞中p65蛋白表达水平升高。与sh-NC组相比,sh-NEAT1组肺泡上皮细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,MDA含量、ROS水平降低,SOD活性升高,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β减少,细胞中p65蛋白表达水平降低。与sh-NEAT1组相比,sh-NEAT1+PMA组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3、p65蛋白表达增多,MDA含量和ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β增多。结论:下调NEAT1通过降低NF-κB信号通路激活水平抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤和炎症因子释放。

关键词： NEAT1 NF-κB信号肺泡上皮细胞炎症因子氧化损伤

犀地凉血方通过LncRNA NEAT1/miR-485-5p/STAT3调控网络对HaCaT细胞增殖、凋亡影响的研究

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中华皮肤科杂志 2023年第7期56卷 642-650页

作者：唐志铭荆梦晴陆鹭单霄张翠侠张晓宇孟飒徐州市中医院皮肤科徐州221003

目的探讨犀地凉血方对HaCaT细胞LncRNA NEAT1/miR-485-5p/STAT3调控网络及细胞增殖、凋亡的影响。方法以IL-17诱导的HaCaT细胞为研究对象,通过qPCR、Western印迹法检测LncRNA NEAT1、miR-485-5p、STAT3 mRNA和蛋白在HaCaT细胞和正常人表皮角质形成细胞(NHEK细胞)中的表达。采用荧光原位杂交技术(FISH)观察LncRNA NEAT1、miR-485-5p在HaCaT细胞中的表达;采用双萤光素酶报告基因实验验证LncRNA NEAT1、miR-485-5p、STAT3之间的靶向调控关系。犀地凉血方煎煮取汁给予大鼠灌胃后采集含药血清,以含药血清干预和/或LncRNA-NEAT1过表达载体转染HaCaT细胞,将HaCaT细胞分对照组、过表达LncRNA NEAT1组、犀地凉血方组、犀地凉血方+过表达LncRNA NEAT1组,采用qPCR、Western印迹法、流式细胞仪、CCK8等实验技术分别检测LncRNA NEAT1、miR-485-5p、STAT3表达及细胞增殖、凋亡情况。采用独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验进行统计学分析。结果IL-17诱导的HaCaT细胞组LncRNA NEAT1、STAT3 mRNA相对表达水平(1.84±0.21、2.20±0.24)高于NHEK细胞组(1.00±0.11、1.00±0.11,均P1.00±0.12,t=2.94,P=0.015);STAT3、p-STAT3蛋白表达水平(1.27±0.13、2.43±0.16)均高于NHEK细胞组(1.00±0.11、1.00±0.10,t=2.54、3.02,均PNEAT1共定位于HaCaT细胞质。双萤光素酶报告基因实验显示,共转染野生型LncRNA NEAT1、STAT3重组质粒时,miR-485-5p组细胞相对萤光素酶活性明显低于阴性对照组(均PNEAT1、STAT3重组载体质粒时,miR-485-5p组细胞萤光素酶活性与阴性对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。过表达LncRNA NEAT1组HaCaT细胞中LncRNA NEAT1、STAT3(包括STAT3 mRNA和STAT3、p-STAT3蛋白)表达水平高于对照组,miR-485-5p表达水平低于对照组;犀地凉血方组LncRNA NEAT1、STAT3表达水平低于对照组,miR-485-5p表达水平高于对照组;犀地凉血方+过表达LncRNA NEAT1组LncRNA NEAT1、STAT3表达水平低于过表达LncRNA NEAT1组,而miR-485-5p表达水平高于过表达LncRNA NEAT1组(均PNEAT1组HaCaT细胞增殖活性明显高于对照组,犀地凉血方+过表达LncRNA NEAT1组HaCaT细胞增殖活性高于犀地凉血方组,但二者均低于对照组(均PNEAT1组HaCaT细胞凋亡率(5.84%±0.28%)低于对照组(14.75%±0.83%,LSD-t=3.48,P=0.002),而犀地凉血方组(35.72%±3.62%)高于对照组(LSD-t=5.34,P=0.001);犀地凉血方+过表达LncRNA NEAT1组细胞凋亡率(27.64%±2.82%)高于过表达LncRNA NEAT1组(LSD-t=9.06,P1)。结论犀地凉血方能抑制HaCaT细胞增殖并促进其凋亡,作用机制与其干预LncRNA NEAT1/miR-485-5p/STAT3调控网络相关。

关键词：银屑病微RNAs STAT3转录因子角蛋白细胞细胞增殖细胞凋亡犀地凉血方 LncRNA NEAT1

Pan-cancer analysis of long non-coding RNA NEAT1 in various cancers

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Genes & Diseases 2018年第1期5卷 27-35页

作者： Shufen Li Jingming Li Chen Chen Rongsheng Zhang Kankan Wang State Key Laboratory of Medical Genomics and Shanghai Institute of Hematology Ruijin HospitalShanghai Jiao Tong University School of MedicineShanghaiChina McMaster University HamiltonOntarioCanada

Changes in the abundance and activity of long non-coding RNAs(lncRNAs)have an important impact on the development of cancer.The nuclear paraspeckle assembly transcript 1(NEAT1)has been reported to be overexpressed in many types of cancer since its discovery.However,inconsistencies exist as NEAT1 can also function as a tumor suppressor in certain types of cancer,such as acute promyelocytic leukemia.Here we systematically describe our current understanding of NEAT1 in tumor initiation and progression.First,we analyzed the expression patterns of NEAT1 in various normal tissues and malignant cancers using data from public data portals,the Genotype-Tissue Expression Project(GTEx)and the Cancer Genome Atlas(TCGA),together with recent progress in the study of NEAT1 in various types of cancer.Second,we discussed the functions and mechanisms of NEAT1 in modulating tumor activity.Then,the upstream transcription factors and downstream microRNA targets of NEAT1 in the transcription cascade of cancers were also summarized.These data highlight the emerging role of NEAT1 in tumorigenesis,and present promising targetable pathways and clinical opportunities for tumor prevention and classifications.

关键词： Cancer Long non-coding RNA NEAT1 Pan-cancer analysis Regulation

E. coli诱导的肠道菌群紊乱通过NEAT1促进视网膜下新生血管

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E. coli诱导的肠道菌群紊乱通过NEAT1促进视网膜下新生血管

作者：张菁倩江南大学

学位级别：硕士

目的:视网膜下新生血管(subretinal neovascularization,SRNV)是新生血管性年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)等多种不可逆性致盲性眼病的共同致病基础。环境因素和遗传因素的相互作用对于SRNV的进展有重要影响... 详细信息

目的:视网膜下新生血管(subretinal neovascularization,SRNV)是新生血管性年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)等多种不可逆性致盲性眼病的共同致病基础。环境因素和遗传因素的相互作用对于SRNV的进展有重要影响,而近期的研究表明肠道菌群紊乱可能在SRNV发生发展中起作用。基于环境改变通常导致的肠道菌群紊乱和表观遗传学中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)在血管生成中的重要作用,本研究旨在探究lnc RNA在肠道菌群紊乱影响SRNV过程中的作用和机制,以此为SRNV的治疗提供新的思路。方法:(1)体内采用激光诱导的SRNV小鼠模型,并通过大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)活菌诱导其肠道菌群紊乱,取小鼠视网膜组织制作铺片,用Isolectin B4对视网膜铺片进行染色并计算SRNV面积,评估肠道菌群紊乱对SRNV的影响。提取SRNV小鼠视网膜RNA,进行转录组测序和数据分析,结合公开数据库中的AMD患者视网膜转录组测序数据,找出高保守的差异表达lnc RNA核散斑组装转录本1(Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1,NEAT1),并在小鼠中进行定量PCR(q PCR)验证。通过皮尔森相关性分析,筛选与NEAT1高度相关且在SRNV中有表达差异的基因,进行功能富集分析。对最后筛选得到的人与小鼠共有的新生血管相关差异表达基因(differentially expressed genes,DEG)富半胱氨酸蛋白61(Cysteine Rich Angiogenic Inducer 61,CYR61)、肝素结合EGF样生长因子(Heparin Binding EGF Like Growth Factor,HBEGF)、FAS细胞表面死亡受体(Fas Cell Surface Death Receptor,FAS),在小鼠中进行q PCR验证,通过单细胞转录组测序分析其表达分布。通过酶联免疫分析小鼠外周血中脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)浓度的改变情况,并结合测序数据,分析E.coli对LPS相关通路的影响。(2)体外使用人视网膜微血管内皮细胞系(HRMEC)。用大肠杆菌细胞壁成分LPS刺激HRMEC,以评估E.coli诱导的肠道菌群紊乱可能通过LPS对血管内皮细胞产生的影响,观察细胞行为学变化,及NEAT1、CYR61和血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)的分子水平。用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)敲低NEAT1,研究NEAT1对细胞功能的作用及下游分子通路。通过Cell Counting Kit-8(CCK8)实验观察细胞增殖,划痕实验观察细胞迁移,小管形成实验观察血管生成能力,q PCR检测RNA水平变化,Western Blot检测蛋白水平变化。靶向NEAT1不同结构域设计ASO,研究其对于CYR61和VEGFA的调控。同时研究总体敲低NEAT1和特异性敲低NEAT1＿2对基因表达、功能和通路的差异作用,以及对细胞行为学的影响。结果:(1)NEAT1是SRNV小鼠和AMD患者视网膜中共有的差异表达lnc RNA,并在E.coli导致的肠道菌群紊乱促进小鼠SRNV过程中进一步显著上调。共有55个基因在AMD患者和SRNV小鼠中均与NEAT1高度相关,其中的30个在AMD晚期患者中差异表达。这30个基因富集到的功能主要与细胞增殖、迁移、分化、凋亡和血管生成等有关。并且在这30个基因中,Cyr61、Hbegf、Fas在肠道菌群紊乱的SRNV小鼠中仍然与NEAT1高度相关。在Cyr61、Hbegf和Fas中,Cyr61在肠道菌群紊乱促进小鼠SRNV过程中上调倍数最大,在单细胞转录组测序数据中与NEAT1的表达都主要位于周细胞,呈明显共表达。E.coli的干预会影响LPS相关通路。(2)体外LPS刺激HRMEC上调NEAT1、CYR61、VEGFA表达水平,并促进细胞增殖、迁移和血管生成能力。体外敲低NEAT1下调CYR61和VEGFA表达水平,抑制HRMEC的增殖、迁移和血管生成能力。提示NEAT1调控血管生成和参与SRNV的发展。靶向不同NEAT1转录本敲低发现,NEAT1调控CYR61、VEGFA可能与参与散斑组成的NEAT1＿2有关。总体敲低NEAT1和特异性敲低NEAT1＿2对基因表达、功能与通路的作用有一定相似之处,例如都会影响蛋白结合、细胞周期、血管生成等功能;也存在一些不同,如总体敲低NEAT1会更明显影响m RNA剪接和DN

关键词：视网膜下新生血管肠道菌群长链非编码RNA NEAT1 转录组测序

沉默LncRNA NEAT1通过miR-193a-3p下调MMP14减轻脑缺血再灌注神经元损伤

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沉默LncRNA NEAT1通过miR-193a-3p下调MMP14减轻脑缺血再灌注神经...

作者：王鹏南昌大学

学位级别：硕士

背景:近年来,缺血性中风（ischemic stroke）已成为全球致残和死亡的主要原因之一。缺血性脑卒中引起的脑损伤主要是由颅内缺血引起的一系列神经病理疾病,如缺氧、氧化应激、水肿形成、炎症反应等。临床实践发现,当脑缺血一定时间再恢... 详细信息

背景:近年来,缺血性中风（ischemic stroke）已成为全球致残和死亡的主要原因之一。缺血性脑卒中引起的脑损伤主要是由颅内缺血引起的一系列神经病理疾病,如缺氧、氧化应激、水肿形成、炎症反应等。临床实践发现,当脑缺血一定时间再恢复血液供应后,部分病人的大脑功能不但未能恢复,反而出现了更加严重的脑功能障碍,这一现象临床上称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemiareperfusion injury,CIRI）,严重影响患者预后,给脑卒中的再灌注治疗带来了极大挑战。因此,识别CIRI发病和进展有关的细胞和分子过程已成为优先考虑的问题。长非编码RNA（Long non coding RNAs,lncRNAs）是一类含有200多个核苷酸的非蛋白质编码RNA,参与染色质修饰、转录调控、核内转运等一系列生物过程调控。最近,越来越多的证据表明Lnc RNAs参与CIRI的病理进程。其中长链非编码RNA核富集转录本（Lnc RNA neat）1与许多细胞内调节因子相互作用,在心、脑血管病病理过程中发挥关键作用。目的:通过构建原代神经元糖氧剥夺/复氧和大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型,来探讨lncRNA NEAT1/mi R-193a-3p/MMP14轴在脑缺血再灌注中调控神经元损伤的机制。方法:1、通过对原代皮质神经元细胞进行糖氧剥夺/复氧复糖（oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）处理构建体外模型,对大鼠手术构建大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）组和假手术组大鼠体内模型。分别观察lncRNA NEAT1在体内体外脑缺血再灌注损伤模型中的表达变化;转染lncRNA NEAT1干扰慢病毒至神经元细胞中,观察经OGD/R处理的神经元细胞凋亡和细胞毒性指标及凋亡相关蛋白的变化。2、通过生物信息学网站star Base和micro ***分析并预测得到竞争性内源RNA（competitive endogenous RNAs,ce RNA）作用途径的mi R-193a-3p及下游靶基因MMP14,转染lncRNA NEAT1干扰慢病毒至神经元OGD/R细胞模型中,分别转染MMP14敲低或过表达质粒、mi R-193a-3p inhibitor至原代神经元细胞中,观察经OGD/R处理的原代神经元细胞凋亡和细胞毒性指标及凋亡相关蛋白的变化。3、大鼠进行侧脑室注射LV-NEAT1-sh RNA慢病毒,7天后构建大鼠MCAO/R模型,缺血1h再灌注24h后,采用Bederson评分法、TTC染色、HE染色和TUNEL染色对大鼠神经功能、脑梗死体积及神经元凋亡进行评价。结果:1、构建大鼠脑缺血再灌注体内、体外模型后,发现lncRNA NEAT1在大鼠皮层缺血脑组织和OGD/R诱导的原代神经元细胞中的表达显著上调;在OGD/R诱导的原代神经元细胞中,干扰lncRNA NEAT1的表达可以显著减少原代神经元细胞的凋亡和LDH的释放,凋亡相关蛋白的表达。2、lncRNA NEAT1干扰慢病毒和mi R-193a-3p inhibitor联合干预原代神经元细胞后,观察到干扰lncRNA NEAT1对神经元的缺血性损伤保护作用可被显著抑制;利用lncRNA NEAT1干扰慢病毒和MMP14敲低质粒联合干预原代神经元细胞后,观察到干扰lncRNA NEAT1对神经元损伤的保护作用没有明显改变,过表达MMP14后不仅增加了OGD/R处理导致的神经元细胞凋亡,而且抑制了干扰lncRNA NEAT1对神经元细胞凋亡的保护作用;3、动物实验发现,同对照组相比,MCAO/R组大鼠脑梗死体积增大、神经功能缺损评分显著增加;皮层神经元核深染和核固缩加剧,空泡增多;皮层神经元凋亡率显著增多。LV-NEAT1-sh RNA组大鼠皮层梗死体积明显缩小、神经功能缺损评分明显改善;皮层神经元的核深染、核固缩加剧和空泡形成明显减轻,皮层神经元的凋亡率明显减少。结论:综上研究结果表明,在原代神经元OGD/R模型和大鼠MCAO/R模型中mi R-193a-3p的表达显著下调,lncRNA NEAT1和MMP14的表达显著上调,提示lncRNA NEAT1、mi R-193a-3p、MMP14在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用。机制研究结果显示lncRNA NEAT1通过吸附mi R-193a-3p从而调控其下游靶基因MMP14的表达,进而促进缺氧复氧损伤诱导的神经元损伤,揭示了CIRI中一个关键的lncRNA NEAT1/mi R-193a-3p/MMP14功能轴,为CIRI提供了新的潜在治疗靶标。

关键词：脑缺血再灌注损伤 NEAT1 竞争性内源RNA 神经元凋亡

内皮细胞来源外泌体中的Lnc NEAT1通过DDX3X/NLRP3轴调节巨噬细胞极化促进骨再生

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内皮细胞来源外泌体中的Lnc NEAT1通过DDX3X/NLRP3轴调节巨噬细胞...

作者：陈宇轩华中科技大学

学位级别：硕士

目的:骨缺损的修复是一个复杂的过程,缺损处的免疫炎症反应与新骨再生之间存在着密切的相互关系。巨噬细胞在免疫炎症反应过程中十分重要。外泌体是细胞间传递信息的信使,其中的Lnc RNA发挥着十分重要的作用。然而,人脐静脉内皮细胞(HUV... 详细信息

目的:骨缺损的修复是一个复杂的过程,缺损处的免疫炎症反应与新骨再生之间存在着密切的相互关系。巨噬细胞在免疫炎症反应过程中十分重要。外泌体是细胞间传递信息的信使,其中的Lnc RNA发挥着十分重要的作用。然而,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)外泌体中Lnc RNA调节巨噬细胞极化,促进骨修复的潜在机制尚不明确。本研究旨在探索HUVECs外泌体核富集转录本1(NEAT1)在巨噬细胞M2极化并促进成骨中的作用及机制。方法:1、通过超速离心法获取HUVECs衍生的外泌体(Exos)和敲低Lnc RNA NEAT1的HUVECs衍生的外泌体(si-Exos)。利用透射电镜、粒径分析、蛋白免疫印迹实验(WB)对两种外泌体进行鉴定。于体外利用Exos和si-Exos处理脂多糖(LPS)刺激后的RAW264.7细胞,应用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR),探究两种外泌体在体外改变巨噬细胞极化状态的能力。使用上述外泌体及外泌体处理的巨噬细胞条件培养基培养骨髓间充质干细胞(BMSCs),应用q RT-PCR、WB、碱性磷酸酶染色、迁移实验探究其对于BMSCs成骨及迁移能力的影响。2、应用过表达质粒转染巨噬细胞使之过表达死盒螺旋酶3X(DDX3X),使用q RTPCR验证转效率。分别使用Exos及si-Exos对巨噬细胞进行处理。WB用于测定Exos及si-Exos处理后DDX3X及结节样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体相关蛋白的表达情况,以探索Exos中NEAT1对DDX3X/NLRP3轴的调节关系。3、ELISA及免疫荧光染色用于分析C57小鼠air pouch模型灌洗液中炎症相关的细胞因子变化及囊壁巨噬细胞浸润情况。构建海藻酸钠/甲基丙烯酸酯(Gel MA)双交联水凝胶用于分别负载Exos及si-Exos。应用荧光染色、绘制释放曲线及透射电镜观察海藻酸钠/Gel MA双交联水凝胶中外泌体的分布及释放情况。选择SD大鼠颅骨缺损模型研究Exos及si-Exos在体内的骨修复能力,使用micro-CT分析骨缺损区域新生骨体积变化,使用组织学染色观察其组织学变化。结果:1、Exos及si-Exos均表达外泌体的典型表面标志物且粒径无显著差异。HUVECs来源外泌体中的NEAT1促进了巨噬细胞M2极化并抑制了LPS引起的炎症反应。Exos及si-Exos处理后的巨噬细胞的条件培养基促进了BMSCs的迁移和成骨分化,且使用Exos处理的条件培养基促进迁移及成骨效果最强。2、外泌体在海藻酸钠/Gel MA双交联水凝胶中分布均匀。释放试验表明,在第15天时仍可保留50%的外泌体,且释放出的外泌体仍保持完整形态。在air pouch模型中,外泌体可显著减轻LPS诱导的炎症反应,并增加囊壁中M2型巨噬细胞的浸润。在颅骨缺损模型中,负载Exos及si-Exos的水凝胶促进了大鼠颅骨缺损的修复及血管化,且减少了组织中NLRP3的表达,其中负载Exos的水凝胶促骨再生及抗炎能力最佳。3、Exos较si-Exos更加显著地下调了DDX3X和NLRP3的表达。在RAW264.7中过表达DDX3X后,NLRP3炎症小体相关蛋白以及白细胞介素1β(IL-1β)的表达水平显著上调。使用Exos及si-Exos对过表达DDX3X及LPS刺激的巨噬细胞进行处理后,巨噬细胞中DDX3X、NLRP3炎症小体相关蛋白以及IL-1β的表达受到明显抑制,其中Exos组抑制效果更加显著。结论:HUVECs衍生的外泌体可以通过NEAT1调控DDX3X/NLRP3轴诱导巨噬细胞M2极化,从而减轻炎症反应,促进骨再生。

关键词：外泌体巨噬细胞极化 NEAT1 骨组织工程炎症反应

长链非编码RNA NEAT1在乳腺癌中的研究进展

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现代肿瘤医学 2022年第19期30卷 3607-3610页

作者：邹丹崔乐马铭玉肖惠宋爱琳兰州大学第二医院普通外科甘肃兰州730030

长链非编码RNA NEAT1(lncRNA NEAT1)已经证实在多种恶性肿瘤中有调控作用,其中包括乳腺癌。多个研究表明NEAT1在乳腺癌中过度表达可以促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。一些研究表明在乳腺癌中NEAT1通过调控microRNA发挥其功能,另一... 详细信息

长链非编码RNA NEAT1(lncRNA NEAT1)已经证实在多种恶性肿瘤中有调控作用,其中包括乳腺癌。多个研究表明NEAT1在乳腺癌中过度表达可以促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。一些研究表明在乳腺癌中NEAT1通过调控microRNA发挥其功能,另一些研究表明NEAT1通过诱导上皮间充质转化促进乳腺癌的进展。本文将综述lncRNA NEAT1在乳腺癌进展及耐药中的作用及可能的机制,为进一步研究NEAT1在乳腺癌中的诊断、治疗及预后提供见解。

关键词：乳腺癌 NEAT1 microRNA 上皮间充质转化肿瘤干细胞耐药