E. coli诱导的肠道菌群紊乱通过NEAT1促进视网膜下新生血管

作     者：张菁倩 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈建欢

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：视网膜下新生血管 肠道菌群 长链非编码RNA NEAT1 转录组测序 

摘      要：目的:视网膜下新生血管(subretinal neovascularization,SRNV)是新生血管性年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)等多种不可逆性致盲性眼病的共同致病基础。环境因素和遗传因素的相互作用对于SRNV的进展有重要影响,而近期的研究表明肠道菌群紊乱可能在SRNV发生发展中起作用。基于环境改变通常导致的肠道菌群紊乱和表观遗传学中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)在血管生成中的重要作用,本研究旨在探究lnc RNA在肠道菌群紊乱影响SRNV过程中的作用和机制,以此为SRNV的治疗提供新的思路。方法:(1)体内采用激光诱导的SRNV小鼠模型,并通过大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)活菌诱导其肠道菌群紊乱,取小鼠视网膜组织制作铺片,用Isolectin B4对视网膜铺片进行染色并计算SRNV面积,评估肠道菌群紊乱对SRNV的影响。提取SRNV小鼠视网膜RNA,进行转录组测序和数据分析,结合公开数据库中的AMD患者视网膜转录组测序数据,找出高保守的差异表达lnc RNA核散斑组装转录本1(Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1,NEAT1),并在小鼠中进行定量PCR(q PCR)验证。通过皮尔森相关性分析,筛选与NEAT1高度相关且在SRNV中有表达差异的基因,进行功能富集分析。对最后筛选得到的人与小鼠共有的新生血管相关差异表达基因(differentially expressed genes,DEG)富半胱氨酸蛋白61(Cysteine Rich Angiogenic Inducer 61,CYR61)、肝素结合EGF样生长因子(Heparin Binding EGF Like Growth Factor,HBEGF)、FAS细胞表面死亡受体(Fas Cell Surface Death Receptor,FAS),在小鼠中进行q PCR验证,通过单细胞转录组测序分析其表达分布。通过酶联免疫分析小鼠外周血中脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)浓度的改变情况,并结合测序数据,分析E.coli对LPS相关通路的影响。(2)体外使用人视网膜微血管内皮细胞系(HRMEC)。用大肠杆菌细胞壁成分LPS刺激HRMEC,以评估E.coli诱导的肠道菌群紊乱可能通过LPS对血管内皮细胞产生的影响,观察细胞行为学变化,及NEAT1、CYR61和血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)的分子水平。用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)敲低NEAT1,研究NEAT1对细胞功能的作用及下游分子通路。通过Cell Counting Kit-8(CCK8)实验观察细胞增殖,划痕实验观察细胞迁移,小管形成实验观察血管生成能力,q PCR检测RNA水平变化,Western Blot检测蛋白水平变化。靶向NEAT1不同结构域设计ASO,研究其对于CYR61和VEGFA的调控。同时研究总体敲低NEAT1和特异性敲低NEAT1＿2对基因表达、功能和通路的差异作用,以及对细胞行为学的影响。结果:(1)NEAT1是SRNV小鼠和AMD患者视网膜中共有的差异表达lnc RNA,并在E.coli导致的肠道菌群紊乱促进小鼠SRNV过程中进一步显著上调。共有55个基因在AMD患者和SRNV小鼠中均与NEAT1高度相关,其中的30个在AMD晚期患者中差异表达。这30个基因富集到的功能主要与细胞增殖、迁移、分化、凋亡和血管生成等有关。并且在这30个基因中,Cyr61、Hbegf、Fas在肠道菌群紊乱的SRNV小鼠中仍然与Neat1高度相关。在Cyr61、Hbegf和Fas中,Cyr61在肠道菌群紊乱促进小鼠SRNV过程中上调倍数最大,在单细胞转录组测序数据中与Neat1的表达都主要位于周细胞,呈明显共表达。E.coli的干预会影响LPS相关通路。(2)体外LPS刺激HRMEC上调NEAT1、CYR61、VEGFA表达水平,并促进细胞增殖、迁移和血管生成能力。体外敲低NEAT1下调CYR61和VEGFA表达水平,抑制HRMEC的增殖、迁移和血管生成能力。提示NEAT1调控血管生成和参与SRNV的发展。靶向不同NEAT1转录本敲低发现,NEAT1调控CYR61、VEGFA可能与参与散斑组成的NEAT1＿2有关。总体敲低NEAT1和特异性敲低NEAT1＿2对基因表达、功能与通路的作用有一定相似之处,例如都会影响蛋白结合、细胞周期、血管生成等功能;也存在一些不同,如总体敲低NEAT1会更明显影响m RNA剪接和DNA修复等功能,而细胞增殖负调控、血管生成、细胞迁移功能在特异性敲低NEAT1＿2时被更显著的富集。细胞行为学实验结果表明,NEAT1的总体敲低不影响HRMEC增殖,对血管生成的抑制力弱于针对NEAT1＿2参与散斑组成的结构域的特异性敲低,提示NEAT1不同亚型之间的平衡可能在血管生成中起重要作用。结论:本研究从“肠-视网膜轴角度出发,通过体内和体外研究,发现E.coli诱导的肠道菌群紊乱可以上调NEAT1表达水平,进而增强CYR61和VEGFA的表达,促进血管内皮细胞的增殖、迁移、血管生成,从而促进SRNV的进展。且靶向NEAT1不同结构域敲低在其中的调节具有差异。这为理解NEAT1在肠道菌群影响SRNV过程中的作用及其分子机制,提供了一个新的思路,同时也进一步证实了NEAT1在血管内皮稳态和血管生成中的重要作用,为相关疾病的治疗提供了参考。