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TRAIL联合吉西他滨对肺癌nci-h460细胞增殖和凋亡的影响

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中国肿瘤生物治疗杂志 2011年第3期18卷 296-300页

作者：孙非凡孙铭娟王梁华焦炳华第二军医大学研究生管理大队上海200433 第二军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的：观察吉西他滨（gemcitabine）联合TNF相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）对人肺癌细胞nci-h460增殖和凋亡的影响。方法：MTT法检测nci-h460细胞的增殖,流式细胞术检测nci-h460细胞的凋亡。结果：... 详细信息

目的：观察吉西他滨（gemcitabine）联合TNF相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）对人肺癌细胞nci-h460增殖和凋亡的影响。方法：MTT法检测nci-h460细胞的增殖,流式细胞术检测nci-h460细胞的凋亡。结果：吉西他滨和TRAIL单用或联用均可浓度（0.00110μg/ml）和时间（24、48、72 h）依赖性抑制nci-h460细胞的增殖,两药联用比单用时抑制率更高,3组药物作用72 h时对肿瘤的抑制率分别为14.9%77.5%、23.4%74.8%、22.3%80.5%;作用72 h时两药单用和联用对细胞增殖抑制的IC50分别为0.085 3、0.098 2、0.043 5μg/ml。两药联用对nci-h460细胞增殖的抑制效果还与用药顺序以及两药比例有关,吉西他滨作用24 h后再加TRAIL比TRAIL作用24 h后再加吉西他滨对nci-h460的抑制效果更好,吉西他滨与TRAIL联用的比例为1∶0.3时对nci-h460细胞增殖的抑制率最大。吉西他滨和TRAIL联用时nci-h460细胞的凋亡率显著高于两药单用的凋亡率（49.04%vs29.33%、25.69%,P〈0.01）。结论：吉西他滨与TRAIL联用可协同抑制肺癌细胞nci-h460的增殖、促进细胞凋亡。

关键词：吉西他滨 TNF相关凋亡诱导配体人肺癌细胞 nci-h460 增殖凋亡

顺铂诱导的人nci-h460细胞获得性耐药与p53基因突变的关系

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中华结核和呼吸杂志 2005年第2期28卷 102-107页

作者：王涛徐军钟南山广州医学院第一附属医院广州呼吸疾病研究所在读博士研究生510120

目的　探讨p53基因突变与肺癌化疗后获得性耐药的关系。方法　采用顺铂(DDP)大剂量(50μmol/L)间歇诱导法,体外诱导具有野生型p53基因的人大细胞肺癌ncih460细胞株,建立多药耐药细胞系h460/DDP;用免疫细胞化学法检测P糖蛋白(Pgp)、多药... 详细信息

目的　探讨p53基因突变与肺癌化疗后获得性耐药的关系。方法　采用顺铂(DDP)大剂量(50μmol/L)间歇诱导法,体外诱导具有野生型p53基因的人大细胞肺癌ncih460细胞株,建立多药耐药细胞系h460/DDP;用免疫细胞化学法检测P糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP1)、肺相关蛋白(LRP)、拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)、谷胱甘肽转移酶π(GSTπ)及P53蛋白的表达状况;用荧光免疫法测定P53蛋白磷酸化状态;对p53cDNA全长进行扩增及测序,用含野生型p53基因的质粒pShuttleCMVwtp53cDNA转染耐药细胞,测定转染细胞的药物敏感性。结果　新建立的人大细胞肺癌多药耐药株h460/DDP,对DDP及卡铂的耐药指数分别为1021和998,对氟尿嘧啶、多柔比星、表柔比星、甲氨蝶呤、依托泊苷及异长春新碱等有不同程度的交叉耐药。多药耐药株h460/DDP细胞的P53蛋白滞留于细胞浆,在DDP刺激下不能发生磷酸化;LRP表达明显增加(P005);耐药株细胞p53基因第277位点后插入一个“t”;耐药株转染pShuttleCMVwtp53cDNA后,其耐药性可发生部分(532%)逆转。结论　铂类化疗药物诱导的ncih460细胞p53基因突变与其对化疗药物耐药性的产生有密切关系。

关键词：顺铂 nci-h460 细胞获得性耐药 p53基因基因突变肺癌化学治疗

半边旗提取物5F对非小细胞肺癌nci-h460细胞生长的抑制作用

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肿瘤防治研究 2009年第1期36卷 9-12页

作者：刘义吴科锋李立 George G ChEN Michael KY hSIN Malcolm J UNDERWOOD 梁念慈广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室广东湛江524023 香港新界沙田韦尔斯亲王医院香港中文大学外科系广东医学院生物化学与分子生物学研究所

目的研究半边旗提取物5F对非小细胞肺癌nci-h460细胞生长的抑制作用。方法MTT法检测5F对nci-h460细胞的生长抑制作用;用PI-hoechst荧光双染法和TUNEL法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测5F对DNA含量的影响。结果5F抑制nci-h460细胞的生长,其... 详细信息

目的研究半边旗提取物5F对非小细胞肺癌nci-h460细胞生长的抑制作用。方法MTT法检测5F对nci-h460细胞的生长抑制作用;用PI-hoechst荧光双染法和TUNEL法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测5F对DNA含量的影响。结果5F抑制nci-h460细胞的生长,其效果与5F的浓度和作用时间相关,24、48、72h的IC50分别为:21.40、4.52、1.02μg/ml;荧光双染色法显示经5F作用后细胞出现变形,染色质浓缩,产生凋亡小体;细胞被阻滞在G2/M期。结论5F在体外能有效地抑制nci-h460细胞的生长,其作用可能是通过诱导其凋亡产生的。

关键词：半边旗 5F nci-h460 生长抑制

文殊兰叶氯仿提取物诱导nci-h460细胞凋亡的研究

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肿瘤防治研究 2011年第6期38卷 628-631页

作者：陈建荣杨扬杨月桂林医学院基础医学院广西桂林541004 桂林医学院药学院广西桂林541004

目的研究文殊兰叶氯仿提取物(CE)对非小细胞肺癌nci-h460细胞增殖和凋亡的影响。方法通过MTT法检测CE对nci-h460细胞的生长抑制作用;采用hoechst33258荧光染色法检测CE作用后凋亡细胞形态的变化;通过免疫细胞化学检测细胞凋亡相关蛋白Bc... 详细信息

目的研究文殊兰叶氯仿提取物(CE)对非小细胞肺癌nci-h460细胞增殖和凋亡的影响。方法通过MTT法检测CE对nci-h460细胞的生长抑制作用;采用hoechst33258荧光染色法检测CE作用后凋亡细胞形态的变化;通过免疫细胞化学检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达;采用流式细胞术(FCM)检测CE作用后对细胞周期的影响。结果 CE抑制nci-h460细胞增殖,其24、48、72h的IC50分别为:(36.22±3.04)、(41.21±2.50)、(62.55±3.47)mg/L;荧光染色显示,经CE作用后的细胞出现细胞核裂解,染色质浓缩,产生凋亡小体;免疫细胞化学法显示CE能增强促进凋亡蛋白Bax和降低抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达;FCM检测表明CE作用后的细胞被阻滞在G1/S期。结论 CE在体外能有效地抑制nci-h460细胞生长,其机制可能与改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关。

关键词：非小细胞肺癌 nci-h460 文殊兰叶细胞凋亡

川陈皮素对非小细胞肺癌nci-h460细胞中tubulin、Raf-1及Bcl-2表达的影响

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中药药理与临床 2009年第2期25卷 20-23页

作者：刘义卢虹玉吴科锋李延平广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室湛江524023 广东海洋大学食品科技学院湛江524088

目的:研究川陈皮素对非小细胞肺癌nci-h460细胞tubulin、Raf-1、Bcl-2表达的影响。方法:MTT法检测川陈皮素对nci-h460细胞的生长抑制作用;用PI-hoechst荧光双染法观察细胞凋亡形态;Western blot检测川陈皮素对nci-h460细胞tubulin、Raf-... 详细信息

目的:研究川陈皮素对非小细胞肺癌nci-h460细胞tubulin、Raf-1、Bcl-2表达的影响。方法:MTT法检测川陈皮素对nci-h460细胞的生长抑制作用;用PI-hoechst荧光双染法观察细胞凋亡形态;Western blot检测川陈皮素对nci-h460细胞tubulin、Raf-1及Bcl-2蛋白表达的影响;体外微管蛋白聚合-解聚平衡体系研究川陈皮素对微管蛋白聚合的影响。结果:川陈皮素体外作用nci-h460细胞24、48、72h后的IC50分别为23.5、11.3、3.81μmol/L;荧光双染色法显示经20μmol/L川陈皮素作用后细胞出现变形,染色质浓缩,产生凋亡小体;40μmol/L川陈皮素作用细胞3、6、12、24h后,未聚合的tubulin及Raf-1表达逐渐增加,Bcl-2表达呈下降趋势;10μmol/L川陈皮素在体外能破坏微管蛋白的动态平衡体系,抑制微管蛋白的聚合。结论:川陈皮素能抑制细胞中微管蛋白的聚合从而影响Raf-1及Bcl-2这一信号途径,这可能是其在体外抑制非小细胞肺癌nci-h460细胞的生长且诱导凋亡机制。

关键词：川陈皮素 nci-h460 微管蛋白凋亡

去氧紫草素对人大细胞肺癌nci-h460细胞株的抑癌作用研究

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去氧紫草素对人大细胞肺癌NCI-H460细胞株的抑癌作用研究

作者：周珊珊阜阳师范大学

学位级别：硕士

为探究中药单体去氧紫草素对人大细胞肺癌nci-h460的抑制作用,本研究开展了以下实验:(1)在细胞学实验中,将处于对数生长期的人大细胞肺癌nci-h460细胞株随机分为空白对照组,DMSO组,阳性对照组(5-Fu,5氟尿嘧啶,80μM)以及去氧紫草素不同... 详细信息

为探究中药单体去氧紫草素对人大细胞肺癌nci-h460的抑制作用,本研究开展了以下实验:(1)在细胞学实验中,将处于对数生长期的人大细胞肺癌nci-h460细胞株随机分为空白对照组,DMSO组,阳性对照组(5-Fu,5氟尿嘧啶,80μM)以及去氧紫草素不同浓度组[四甲基噻唑蓝(MTT)实验、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验和细胞凋亡检测实验:4,6,8,10μM;平板克隆集落形成实验:0.5,1,1.5μM],通过MTT实验和细胞平板克隆集落形成实验细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验以及一步法TUNEL细胞凋亡检测实验检测不同浓度的去氧紫草素对nci-h460细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响;(2)在动物实验中本研究选取Balb/c雄性裸鼠,以皮下接种nci-h460细胞的方式构建裸鼠皮下荷瘤模型,按照每组肿瘤体积平均值140 mm左右将成瘤裸鼠随机分为空白对照组、阳性对照组和去氧紫草素组,每组3只,分别灌胃给予0.5%CMC-Na(100μL)、5-Fu(25 mg/kg,100μL)、0.5%CMC-Na+去氧紫草素(5 mg/kg,100μL),灌胃周期为15 d,灌胃结束收取血清和肿瘤组织,通过h&E染色和免疫组化来探究去氧紫草素在动物体内对nci-h460瘤体的抑制作用;(3)随后本研究通过网络药理学和细胞转录组学测序分析去氧紫草素对nci-h460细胞作用的差异表达基因及潜在的信号通路,以此来初步探究去氧紫草素抑制人大细胞肺癌nci-h460的作用机制。实验结果如下:(1)MTT实验结果显示,与空白对照组相比,随着去氧紫草素浓度的升高nci-h460细胞的存活率逐渐降低,呈明显的剂量依赖性,并在8μM时达到最低;细胞平板克隆集落形成实验结果表明,随着去氧紫草素浓度的增大,细胞集落数目逐渐减少,1.5μM时集落形成数最少;(2)细胞划痕实验结果显示,与空白对照组相比,不同浓度的去氧紫草素对nci-h460细胞的迁移能力均有明显的抑制效果,且在10μM时,细胞迁移率最低;(3)Transwell细胞侵袭实验结果显示,随着去氧紫草素浓度的升高,穿过上室到达下室的细胞数目越来越少,呈现明显的剂量依赖性,去氧紫草素浓度为10μM时侵袭细胞数目最少;(4)TUNEL细胞凋亡检测结果表明,去氧紫草素浓度越大,绿色荧光亮度越强,说明细胞凋亡现象越明显,呈明显的剂量依赖性,在4μM时已出现绿色荧光,在10μM时绿色荧光亮度最强,细胞凋亡现象最明显;(5)Balb/c裸鼠皮下接种nci-h460细胞成瘤实验结果显示,去氧紫草素(5 mg/kg)组的肿瘤体积和RTV值与空白对照组相比均有减小,且去氧紫草素组的裸鼠体重变化趋势与空白对照组基本一致,均稳中有升,说明5 mg/kg的去氧紫草素在Balb/c裸鼠体内能够较好的抑制nci-h460肿瘤的增殖且对裸鼠的正常生理生活影响较小;h&E染色结果显示,与CMC-Na组相比,去氧紫草素组肿瘤组织显示出明显的肿瘤细胞收缩、破碎、稀疏排列,肿瘤内出现空泡化及坏死。免疫组化结果显示,去氧紫草素组与CMC-Na组相比Ki-67表达量降低,说明经去氧紫草素处理后肿瘤的增殖能力下降,而E-Cad的表达量与CMC-Na组相比是升高的,说明经去氧紫草素处理后肿瘤细胞间的粘附性增加,因而肿瘤的迁移能力受到抑制;(6)网络药理学分析结果显示去氧紫草素可能通过BCL-2、CCNE 1、CCNE2、CDC 25 A等35个靶点作用于非小细胞肺癌并可能通过诱导细胞凋亡而对nci-h460细胞产生抑癌作用;细胞转录组测序结果显示去氧紫草素可能主要通过影响脂质与动脉粥样硬化、类固醇激素生物合成、细胞凋亡以及PPAR信号通路来抑制人大细胞肺癌nci-h460。综上,去氧紫草素在细胞学实验中对人大细胞肺癌细胞株nci-h460的增殖、迁移和侵袭均有明显的抑制作用,且在4μM时已出现凋亡现象;在Balb/c裸鼠体内实验中,5 mg/kg的去氧紫草素能够较好地抑制nci-h460肿瘤的增殖且对裸鼠正常的生理生活影响较小,h&E染色结果显示经去氧紫草素处理后肿瘤细胞出现破碎、空泡化,免疫组化结果显示经去氧紫草素处理后Ki-67的表达量降低,说明肿瘤细胞的增殖能力受到抑制,同时E-Cad的表达量升高,细胞间粘附性增加,因而肿瘤细胞的迁移能力被抑制;细胞转录组测序结果显示去氧紫草素作用于人大细胞肺癌nci-h460的机制可能与脂质与动脉粥样硬化、类固醇激素生物合成、细胞凋亡以及PPAR信号通路等有关。本研究通过细胞学实验、动物实验、网络药理学分析以及细胞转录组测序进行了中药单体去氧紫草素对人大细胞肺癌nci-h460细胞的抑制作用研究,以期为中药单体去氧紫草素治疗人大细胞肺癌nci-h460提供新的实验参考数据

关键词：去氧紫草素 nci-h460 抑癌作用研究细胞转录组测序

木棉花水提物对人肺癌nci-h460细胞体内外抑制作用及机制研究

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木棉花水提物对人肺癌NCI-H460细胞体内外抑制作用及机制研究

作者：唐微艳广西医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题以人肺癌nci-h460细胞为研究对象,研究木棉花水提物对人肺癌nci-h460细胞体外的抑制作用,并建立人肺癌nci-h460细胞裸鼠移植瘤模型,探讨其抑瘤作用及机制。方法:1.常规培养nci-h460细胞后,不同浓度(20、40、80、160、320、64... 详细信息

目的:本课题以人肺癌nci-h460细胞为研究对象,研究木棉花水提物对人肺癌nci-h460细胞体外的抑制作用,并建立人肺癌nci-h460细胞裸鼠移植瘤模型,探讨其抑瘤作用及机制。方法:1.常规培养nci-h460细胞后,不同浓度(20、40、80、160、320、640、1280、2560μg/mL)的木棉花水提物分别作用nci-h460细胞24、48、72h后,采用MTT法检测木棉花水提物对nci-h460细胞增殖抑制作用,计算半数抑制浓度(IC)。2.人肺癌nci-h460细胞培养至对数生长期,状态较好时,取细胞密度为1×10/mL的混悬液0.2mL接种于裸鼠右后肢皮下,成功建立nci-h460细胞裸鼠移植瘤模型。3.选取造模成功的荷瘤裸鼠20只,随机分为模型组、木棉花水提物高、低剂量组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组,每组5只。另取5只正常裸鼠作为正常组。正常组和模型组予等体积的蒸馏水灌胃,每天一次;木棉花水提物组分别以木棉花水提物生药量浓度1.2g/kg、0.6 g/kg的剂量灌胃,每天一次;CTX组以CTX 0.025 g/kg的剂量腹腔注射(ip),隔天给药一次。给药期间,隔天测量裸鼠移植瘤体积。持续给药干预13 d。第14d摘眼球法取血后,脱颈法处死裸鼠,剥取瘤体、肺脏、脾脏和肝脏,并分别称重计算抑瘤率、肺脏指数、脾脏指数和肝脏指数。4.采用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定血清中白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。5.采用WST-1法测定肿瘤组织中超氧化物歧化酶(SOD)的含量;硫代巴比妥酸法(TBA法)测定肿瘤组织中丙二醛(MDA)的含量。6.苏木素-伊红染色法(hE)观察瘤组织的病理形态学变化。7.采用酶免疫组化法观察木棉花水提物对人肺癌nci-h460裸鼠移植瘤组织中Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2、p53蛋白表达的影响。结果:1.体外MTT实验结果显示,各浓度木棉花水提物作用48h和72h后,对人肺癌nci-h460细胞的增殖抑制作用显著,且在一定范围内,增殖抑制作用随给药浓度和作用时间的增加而增加。作用48h后木棉花水提物各浓度对人肺癌nci-h460细胞的抑制率分别为12.2%、18.3%、19.1%、13.4%、15.8%、21.8%、34.6%、62.6%,作用72h后抑制率分别为7.4%、14.4%、14.8%、31.3%、40.5%、48.7%、58.2%、75.8%。作用48h后半数抑制浓度(48h-IC)为2002.4μg/mL;作用72h后72h-IC为728.4μg/mL。2.人肺癌nci-h460细胞裸鼠移植瘤造模成功,成瘤率为100%。3.处死裸鼠后剥离瘤体测定结果显示,与模型组比较,木棉花水提物高剂量组裸鼠移植瘤的体积和瘤重均显著减小(P0.05)。木棉花水提物高、低剂量组的抑瘤率分别为59.7%、30.5%。***法检测结果显示,木棉花水提物高剂量组血清中TNF-α含量与正常组比较,差别无统计学意义(P>0.05),木棉花水提物低剂量组血清中TNF-α含量低于正常组(P0.05);与模型组比较,木棉花水提物高、低剂量组血清中IL-6水平显著升高,差别有统计学意义(P0.05)。***染色实验结果显示,模型组肿瘤组织中癌细胞排列紧密,生长旺盛,细胞核大,坏死面积较少;木棉花水提物各给药组肿瘤组织中癌细胞有不同程度坏死,可见细胞核溶解、消失等。癌细胞数目明显减少,且大小不一,胞间疏松,细胞核较小,包浆部分破裂,不完整。7.环磷酰胺组和木棉花水提物高、低剂量组免疫组化试验结果显示,木棉花高、低剂量组肿瘤组织中Caspase-3着色积分光密度(IOD)均高于模型组,差别有统计学意义(P<0.01);木棉花水提物高剂量组肿瘤组织中Caspase-9、Bax、p53着色积分光密度(IOD)均高于模型组,Bcl-2着色积分光密度(IOD)低于模型组,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01);木棉花水提物低剂量组肿瘤组织中Caspase-9、Bax、p53、Bcl-2着色积分光密度(IOD

关键词：裸鼠移植瘤 nci-h460 木棉花水提物免疫组化积分光密度

新型萘酰亚胺化合物NA17诱导非小细胞肺癌nci-h460细胞凋亡的作用机制研究

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新型萘酰亚胺化合物NA17诱导非小细胞肺癌NCI-H460细胞凋亡的作用...

作者：马凤娥广西师范大学

学位级别：硕士

肺癌是全世界癌症死亡的主要原因之一,在肺癌患者中80%-90%为非小细胞肺癌(NSCLC)。近40年来,由于一直未找到有效的治疗方法,致使肺癌转移患者的总体存活率不足一年。分子靶向治疗药物的问世,重新鼓舞了人们对于肺癌治疗的信心。但以EGF... 详细信息

肺癌是全世界癌症死亡的主要原因之一,在肺癌患者中80%-90%为非小细胞肺癌(NSCLC)。近40年来,由于一直未找到有效的治疗方法,致使肺癌转移患者的总体存活率不足一年。分子靶向治疗药物的问世,重新鼓舞了人们对于肺癌治疗的信心。但以EGFR为靶点的分子靶向治疗药物并没有改善肺癌晚期患者致死率高的现状。因此,针对肺癌特别是非小细胞肺癌分子遗传学背景寻找新型治疗靶点是开发临床有效靶向治疗药物的关键所在。其中抑癌基因p53失活业已成为非小细胞肺癌发病和治疗无效的常见诱因,在非小细胞肺癌重构p53功能作为有效的靶向治疗手段引起了国内、外学者的高度关注。本课题组自主组合成了一系列新型萘酰亚胺衍生物,pp53-TA-Luc报告基因筛选结果显示萘酰亚胺衍生物NA17可以显著增加p53的活性,且能够有效抑制肿瘤细胞株的生长。但是NA17的作用靶点及其发挥抗肿瘤作用的分子机制尚不清晰,本文利用分子药理学领域的多种实验方法对NA17的抗肿瘤作用机制进行了深入的研究,明确了 NA17的作用靶点,为该化合物的后续研究提供理论依据和数据参考。1.本文首先通过MTT法对NA17进行体外抗肿瘤活性筛选。对肿瘤细胞株(nci-h460、BEL-7404、hCT-116、MCF-7、hep G2、MGC-803)和正常细胞株(hL-7702、WI-38)进行细胞活力检测,结果表明NA17具有广谱的抗肿瘤活性,对多种肿瘤细胞株均表现出显著的增殖抑制作用,而且对正常细胞毒性较低,有较好的选择性。不同种类的非小细胞肺癌细胞株(nci-1975、nci-358、nci-827)对NA17的敏感程度不同,这主要与其内源性p53活化程度不同有关。此外,通过RNA干扰降低内源性p53的表达能显著降低肿瘤细胞对NA17的敏感性,说明NA17是通过激活p53发挥抗肿瘤作用。2.蛋白质免疫印迹实验结果表明NA17以浓度依赖性方式诱导p53丝氨酸392位点磷酸化(p-p53s392)。亚细胞分布、DNA损伤检测、Coip-MS和蛋白质免疫印迹实验结果显示NA17是在细胞质中与nci-h460细胞中的p53直接相互作用,使野生型p53活化,而不是通过DNA损伤或者增加内源性p53的表达。3.通过流式细胞术检测NA17对细胞周期的影响。结果表明,NA17将nci-h460细胞阻滞在G1期。通过蛋白质免疫印迹实验检测G1期相关调控蛋白的表达量,结果表明,NA17可以通过上调G1期监测点调控蛋白p21的表达来影响cyclin-CDK4复合体的活性从而有效诱导细胞阻滞在G1期。4.通过hoechst33258染色、AIF免疫荧光检测、caspase-3激活检测NA17对细胞凋亡的影响。结果表明NA17可以诱导细胞发生早期凋亡。AIF亚细胞分布实验、线粒体中关键凋亡蛋白Bcl-xl的下调和Bim、Bax以及Bak的上调说明NA17是通过内源性凋亡通路诱导细胞凋亡。分子水平进一步研究表明,磷酸化p53(p-p53)靶向线粒体并在线粒体中聚积使得Bak构象激活,导致细胞凋亡。本文系统的研究了 NA17的药理活性和作用机制,结果表明NA17通过直接作用于野生型p53使其丝氨酸 392位点发生磷酸化,磷酸化的p53靶向聚集在线粒体中发挥周期阻滞和细胞凋亡的功能,从而发挥抗肿瘤作用。

关键词： NA17 nci-h460 p53 萘酰亚胺衍生物肺癌

UCh-L3基因真核表达质粒的构建及其在雷帕霉素诱导的nci-h460细胞自噬中的作用的研究

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UCH-L3基因真核表达质粒的构建及其在雷帕霉素诱导的NCI-H460细胞...

作者：姚冰洁大连医科大学

学位级别：硕士

目的：本研究通过构建UCh-L3真核表达质粒,转染nci-h460细胞,并且加入雷帕霉素诱导nci-h460细胞自噬,分别检测未转染组、转染质粒pcDN A3.1(+)-UCh-L3-EGFP组及转染质粒pcDNA3.1(+)-EGFP组nci-h460细胞中LC3-Ⅱ蛋白和UCh-L3蛋白表达的改... 详细信息

目的：本研究通过构建UCh-L3真核表达质粒,转染nci-h460细胞,并且加入雷帕霉素诱导nci-h460细胞自噬,分别检测未转染组、转染质粒pcDN A3.1(+)-UCh-L3-EGFP组及转染质粒pcDNA3.1(+)-EGFP组nci-h460细胞中LC3-Ⅱ蛋白和UCh-L3蛋白表达的改变,进一步探讨UCh-L3在雷帕霉素诱导的nci-h460细胞自噬中的作用。方法：***-L3真核表达质粒的构建：培养nci-h460细胞,运用RT-PCR技术获取人类UCh-L3基因片段,运用双酶切、基因克隆等技术将目的基因片段克隆入质粒pcDNA3.1(+)-EGFP,构建pcDNA3.1(+)-UCh-L3-EGFP真核表达质粒并采用双酶切及测序方法进行鉴定。2.将实验分为未转染组、pcDNA3.1(+)-UCh-L3-EGFP组及pcDNA3.1(+)-EGFP组,采用阳离子脂质体方法转染nci-h460细胞,转染48h后,于荧光倒置显微镜下观察EGFP表达阳性细胞所占的比例,评估转染效率。重复以上转染过程并于转染24h后使用实时荧光定量PCR方法检测UCh-L3基因mRNA表达情况。*** blot方法检测UCh-L3和LC3-Ⅱ蛋白表达水平：实验分为不加药+未转染组、不加药+pcDNA3.1(+)-UCh-L3-EGFP组、不加药+pcDNA3.1(+)-EGFP组、加药+未转染组、加药+pcDNA3.1(+)-UCh-L3-EGFP组、加药+pcDNA3.1(+)-EGFP组,按照分组进行转染及雷帕霉素处理,收集各组细胞并提取总蛋白,采用western blot方法分别检测各组中LC3-Ⅱ蛋白和UCh-L3蛋白表达水平。结果：***-L3真核表达质粒的构建：经双酶切、基因测序等方法证实pcDN A3.1(+)-UCh-L3-EGFP真核表达质粒构建成功。2.转染48h后,将6孔板置于倒置荧光显微镜下,可见有绿色荧光蛋白表达阳性的细胞,阳性表达的细胞数约占总细胞数的50～60%。实时定量PCR方法检测3组UCh-L3基因mRNA的表达,结果显示：与未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组相比,pcDNA3.1(+)-UCh-L3-EGFP组的UCh-L3基因mRNA的表达显著升高(Ph-L3基因mRNA的表达无显著差异(P>0.05)。*** blot方法检测LC3-Ⅱ和UCh.L3蛋白表达水平：(1)与不加药各组相比,加药后各组的LC3-Ⅱ蛋白表达都明显增加,UCh.L3表达减少(Ph-L3-EGFP组由UCh.L3蛋白表达量明显高于未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组(P0.05);(3)加药各组中,pcDNA3.1(+)-UCh-L3-EGFP组与未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组相比,可见LC3-Ⅱ蛋白表达减少(P0.05)结论：1.成功构建pcDNA3.1(+)-UCh-L3-EGFP质粒。2.雷帕霉素可诱导nci-h460细胞发生自噬,并且在自噬过程中UCh-L3蛋白表达下调。3.过表达UCh-L3可使雷帕霉素诱导的细胞自噬过程得到抑制,但其作用的具体机制还不清楚,有待于进一步的研究。

关键词： UCh-L3 质粒构建自噬雷帕霉素 nci-h460