新型萘酰亚胺化合物NA17诱导非小细胞肺癌NCI-H460细胞凋亡的作用机制研究

作     者：马凤娥 

作者单位：广西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁宏;张国海

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：NA17 NCI-H460 p53 萘酰亚胺衍生物 肺癌 

摘      要：肺癌是全世界癌症死亡的主要原因之一,在肺癌患者中80%-90%为非小细胞肺癌(NSCLC)。近40年来,由于一直未找到有效的治疗方法,致使肺癌转移患者的总体存活率不足一年。分子靶向治疗药物的问世,重新鼓舞了人们对于肺癌治疗的信心。但以EGFR为靶点的分子靶向治疗药物并没有改善肺癌晚期患者致死率高的现状。因此,针对肺癌特别是非小细胞肺癌分子遗传学背景寻找新型治疗靶点是开发临床有效靶向治疗药物的关键所在。其中抑癌基因p53失活业已成为非小细胞肺癌发病和治疗无效的常见诱因,在非小细胞肺癌重构p53功能作为有效的靶向治疗手段引起了国内、外学者的高度关注。本课题组自主组合成了一系列新型萘酰亚胺衍生物,pp53-TA-Luc报告基因筛选结果显示萘酰亚胺衍生物NA17可以显著增加p53的活性,且能够有效抑制肿瘤细胞株的生长。但是NA17的作用靶点及其发挥抗肿瘤作用的分子机制尚不清晰,本文利用分子药理学领域的多种实验方法对NA17的抗肿瘤作用机制进行了深入的研究,明确了 NA17的作用靶点,为该化合物的后续研究提供理论依据和数据参考。1.本文首先通过MTT法对NA17进行体外抗肿瘤活性筛选。对肿瘤细胞株(NCI-H460、BEL-7404、HCT-116、MCF-7、Hep G2、MGC-803)和正常细胞株(HL-7702、WI-38)进行细胞活力检测,结果表明NA17具有广谱的抗肿瘤活性,对多种肿瘤细胞株均表现出显著的增殖抑制作用,而且对正常细胞毒性较低,有较好的选择性。不同种类的非小细胞肺癌细胞株(NCI-1975、NCI-358、NCI-827)对NA17的敏感程度不同,这主要与其内源性p53活化程度不同有关。此外,通过RNA干扰降低内源性p53的表达能显著降低肿瘤细胞对NA17的敏感性,说明NA17是通过激活p53发挥抗肿瘤作用。2.蛋白质免疫印迹实验结果表明NA17以浓度依赖性方式诱导p53丝氨酸392位点磷酸化(p-p53s392)。亚细胞分布、DNA损伤检测、Coip-MS和蛋白质免疫印迹实验结果显示NA17是在细胞质中与NCI-H460细胞中的p53直接相互作用,使野生型p53活化,而不是通过DNA损伤或者增加内源性p53的表达。3.通过流式细胞术检测NA17对细胞周期的影响。结果表明,NA17将NCI-H460细胞阻滞在G1期。通过蛋白质免疫印迹实验检测G1期相关调控蛋白的表达量,结果表明,NA17可以通过上调G1期监测点调控蛋白p21的表达来影响cyclin-CDK4复合体的活性从而有效诱导细胞阻滞在G1期。4.通过Hoechst33258染色、AIF免疫荧光检测、caspase-3激活检测NA17对细胞凋亡的影响。结果表明NA17可以诱导细胞发生早期凋亡。AIF亚细胞分布实验、线粒体中关键凋亡蛋白Bcl-xl的下调和Bim、Bax以及Bak的上调说明NA17是通过内源性凋亡通路诱导细胞凋亡。分子水平进一步研究表明,磷酸化p53(p-p53)靶向线粒体并在线粒体中聚积使得Bak构象激活,导致细胞凋亡。本文系统的研究了 NA17的药理活性和作用机制,结果表明NA17通过直接作用于野生型p53使其丝氨酸 392位点发生磷酸化,磷酸化的p53靶向聚集在线粒体中发挥周期阻滞和细胞凋亡的功能,从而发挥抗肿瘤作用。