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作者：杨倩中国海洋大学

学位级别：硕士

密度感应(quorum sensing,QS)是指细菌用于细胞间交流的一种通讯机制,细菌通过分泌一些可在细胞间自由扩散的低分子量信号分子来协调菌群的行为。信号分子的浓度随着菌群数量的增加而增加,当信号分子的浓度达到一定阈值时,受密度感应调... 详细信息

密度感应(quorum sensing,QS)是指细菌用于细胞间交流的一种通讯机制,细菌通过分泌一些可在细胞间自由扩散的低分子量信号分子来协调菌群的行为。信号分子的浓度随着菌群数量的增加而增加,当信号分子的浓度达到一定阈值时,受密度感应调控的基因被激活,菌群中的细菌个体将共同调控某一种或一系列特定功能基因的表达,从而使菌群表现出某种群体性的行为,如产生荧光、分泌毒素等,因此密度感应又称群体感应。尽管最早的密度感应信号分子——酰基高丝氨酸内酯类分子是在费氏弧菌中(Vibrio fischeri)发现的,但至今对多数弧菌科细菌的密度感应系统还所知甚少。弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一,广泛分布于近岸及河口海水、海洋生物的体表和肠道中;有些种类的海洋弧菌是海水养殖业的重要致病菌,其毒力基因的表达往往通过密度感应系统控制。本研究中,我们主要检测了三种密度感应信号分子,即酰基高丝氨酸内酯类自诱导分子(acyl-homoserine lactone, AHLs)、AI-2类自诱导分子(autoinducer-2,AI-2)和霍乱弧菌Ⅰ类自诱导分子(cholerae autoinducer-1,CAI-1)在25株弧菌科细菌中的分布和多样性,并优化了检测CAI-1类信号分子的实验方法。实验结果显示,密度感应信号分子在弧菌科细菌中分布十分广泛,尤其是AHL和AI-2两类分子。除了肋生盐弧菌VIB288和需钠弧菌VIB299外,其它23株弧菌科细菌均能产生一种或多种信号分子。经两株报告菌株哈维氏弧菌JMH612和根癌农杆菌KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410)检测,21株弧菌均能产生AHL信号分子。利用薄层层析法检测到其中8株菌的信号分子类型,其中地中海弧菌VIB296和火神别弧菌VIB414均能产生至少4种AHL信号分子。此外,20株弧菌科细菌具有AI-2类信号分子活性,本文通过PCR扩增得到18株细菌的luxS基因,测序后通过序列比对发现它们均含有两个保守基序,即His-Thr-Leu-Glu-His和[Gln/Lys]-Ile-Pro-[Glu/Asp]-Leu-Asn-Glu-Tyr序列,分别与LuxS保守基序的公式His-Xaa-Xaa-Glu-His和[Lys/Arg]-Xaa-[Asp/Glu]-Xaa-Tyr吻合,并且这些序列之间具有很高的相似性。本研究发现六株弧菌能产生CAI-I类信号分子。值得一提的是,火神别弧菌VIB414,坎贝氏弧菌VIB285,弗尼斯氏弧菌VIB293,伯麦罗氏弧菌LMG20537和两株哈维氏弧菌VIB571及VIB645均能产生三种类型的密度感应信号分子。鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)属于肠杆菌科,是一种能够引发鲶鱼肠败血症(ESC)的革兰氏阴性菌。从越南罹患鲶鱼肠败血症的斑纹鲶鱼中分离到一株病原菌,经16S rDnA测序及表型鉴定确定为一株鲶鱼爱德华氏菌。虽然与其同属的另一种病原菌——迟缓爱德华氏菌已被报道具有两类信号分子活性(AHL及AI-2),但目前为止还没有关于鲶鱼爱德华氏菌密度感应系统的报道。本文利用不同的报告菌株检测了鲶鱼爱德华氏菌Ei-151的密度感应信号分子,结果表明,此菌至少能够产生三种AHL信号分子,且其AHL分子图谱与迟缓爱德华氏菌LTB-4的非常相似。基因背景的研究进一步支持上述实验结果,鲶鱼爱德华氏菌中假定AHL合成酶的基因序列[Genbank: YP02934276]及AHL识别蛋白的基因序列[Genbank: YP02934275]与迟缓爱德华氏菌中相应基因序列的相似性分别为93%和96%。Ei-151菌株在其整个生长周期均能够产生AHL信号分子及AI-2类信号分子,且两种信号分子的浓度均随着菌群密度的增加而增加,并在对数生长期时(OD约为1.8)达到较高水平,然后呈现显著的降低,表明这两种信号分子介导的密度感应系统可能在该菌的基因调控方面同时发挥作用。此外,同迟缓爱德华氏菌一样,鲶鱼爱德华氏菌Ei-151及其标准菌株LMG7860均未检测到CAI-I类信号分子活性。弧菌科细菌及鲶鱼爱德华氏菌均能产生多种复杂的密度感应信号分子,用来应对各种各样的环境因素及选择压力。本文的研究成果为进一步研究密度感应信号分子在这些细菌中所起的作用提供了理论基础。

关键词：弧菌科鲶鱼爱德华氏菌密度感应系统 n-酰基高丝氨酸内酯 AI-2类信号分子 CAI-1类信号分子

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含细菌群体感应淬灭酶的菌种筛选和鉴定

含细菌群体感应淬灭酶的菌种筛选和鉴定

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作者：邱健河北工业大学

学位级别：硕士

细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)参与许多生物学功能的调控,其中包括动植物病原细菌致病因子的产生以及人类某些病原细菌生物膜的形成。酰基高丝氨酸内酯(n-acylhomoserine lactone,AHL)是调控群体感应系统的关键信号分子。近年... 详细信息

细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)参与许多生物学功能的调控,其中包括动植物病原细菌致病因子的产生以及人类某些病原细菌生物膜的形成。酰基高丝氨酸内酯(n-acylhomoserine lactone,AHL)是调控群体感应系统的关键信号分子。近年的研究证明,不同生物体包括细菌和真核生物中都存在类别不同的酰基高丝氨酸内酯降解酶。在AHL依赖型致病菌和转基因植物中AHL降解酶能有效地抑制QS信号分子的积累,从而阻断病原细菌的发病机制,提高了植物的抗病性。这些新颖的群体感应淬灭酶的发现,不仅为防治细菌侵染提供了可行的途径,也对研究它们在宿主中的作用和对生态系统的潜在影响提出挑战。本实验利用酰基高丝氨酸内酯为菌株生长的唯一的碳源和能源,筛选得到两株能够降解AHL的菌株X1和R1。对其进行生理生化鉴定和16SrDnA、18SrDnA分子水平鉴定,菌株X1为细菌,属于黄单胞菌属;菌株R1为酵母菌,属于红冬孢酵母菌属,菌株R1构建的系统发育树显示菌株R1与Rhodosporidium toruloides聚为一群,相似性高达99.9%。并研究了两菌株的最适生长条件及其对不同AHL的降解特性,最适生长温度为28-30℃,最适pH值为7.5左右。对两株菌利用不同碳源的情况进行研究显示,随着不同碳源酰基侧链碳原子个数的增长,菌株X1和R1在相同的培养时间总菌体数都呈线性增加。它们的粗酶液也都具有很强的AHL降解能力,且菌株R1的能力要优于菌株X1。菌株对欧文氏胡萝卜软腐致病菌的拮抗研究表明,无论是菌株X1和R1的菌液本身还是菌株的粗酶液,对致病菌都具有拮抗作用,都能比较明显的抑制软腐病病害。

关键词：群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯群体感应淬灭酶 16SrDnA 18SrDnA 系统发育

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AHL-SdiA抑制大肠埃希菌质粒转移

AHL-SdiA抑制大肠埃希菌质粒转移

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作者：伍彬宁广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:质粒转移是细菌传播耐药基因的重要途径。质粒(plasmid)是的环形DnA,它不仅独立于细菌染色体,而且能自主复制。部分质粒具有转移性,并能携带抗生素耐药基因。广泛宿主质粒能穿梭于细菌间,因此质粒被视为传播耐药的关键媒介。质粒... 详细信息

目的:质粒转移是细菌传播耐药基因的重要途径。质粒(plasmid)是的环形DnA,它不仅独立于细菌染色体,而且能自主复制。部分质粒具有转移性,并能携带抗生素耐药基因。广泛宿主质粒能穿梭于细菌间,因此质粒被视为传播耐药的关键媒介。质粒水平转移的主要途径是细菌的接合作用。接合作用(conjugation)是细菌借助性菌毛相互沟通、传受DnA的过程。因此,细菌接合作用被视为传播抗生素耐药基因的重要途径。AHL是细菌群体感应系统的信号分子。群体感应(quorum sensing,QS)是细菌感知群体数量变化,并调整群体行为的调控系统。其中,脂肪酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine lactones,AHL)是革兰阴性菌QS系统的信号分子,它通过结合LuxR类受体蛋白,实现调控基因表达。蛋白SdiA是QS系统的受体蛋白,同时也是重要的转录因子。蛋白SdiA存在于大肠埃希菌中,能感知并结合其他细菌分泌的AHL。蛋白SdiA拥有DnA结合域,它能结合基因的启动子,以调控基因表达。因此,QS系统通过AHL-SdiA调控基因表达。一般认为,质粒转移的调控是由质粒与宿主共同调控的过程,而受体菌参与接合调控则少有报道。本文推测,受体菌能通过QS系统调控质粒转移:受体菌分泌AHL,通过与宿主的蛋白SdiA结合,两者形成复合物,以调控接合相关基因traI。其中,蛋白TraI能结合质粒复制起始点oriT,参与质粒的复制及转移全过程,直接调控细菌接合作用。因此,本文探究AHL-SdiA与基因traI的调控关系。另外,本文发现蛋白SdiA对sRnA的调控作用,展望后续研究AHL-SdiA-sRnA对细菌接合作用的调控机制。方法:本实验采用大肠埃希菌SM10λπ作为质粒供体菌。该菌染色体被整合了质粒转移的调控元件(包含基因traI),并含有转移性质粒pUC24T。质粒pUC24T具庆大霉素(Gm)抗性,作为候选实验的筛选标记。受体菌则选用铜绿假单胞菌PA01。PA01基因IasI、基因rhlI分别调控3-oxo-C12-HSL、C4-HSL的催化合成,后两者为PA01最主要的AHL。实验主要通过构建接合模型、运用荧光定量PCR(qPCR)检测基因表达量以及启动子报告质粒来验证实验假设。构建接合模型。分别将供、受体菌培养至0.5麦氏浊度单位(MCF)。利用尿液分析仪测细菌浓度,并调配菌液浓度至1.0×107CFU/mL。供、受体菌各取100μL,37℃混合培养6h。筛选合子并计数,换算接合频率。接合频率高,则说明接合作用则强。qPCR检测基因表达量。收集待测菌液,并抽提细菌全RnA组。将RnA反转录为cDnA。以cDnA作为模板,利用qPCR检测目的基因相对表达量。构建基因traI启动子报告质粒pQF50-PtraI。以质粒pQF50为载体,该质粒缺少Laz启动子。运用分子克隆技术,将基因traI启动子及其上游317 bp片段,克隆于β-半乳糖苷酶基因上游。当基因traI启动子被激活时,其下游β-半乳糖苷酶基因也被激活。后续通过β-半乳糖苷酶试验(OnPG试验)检测酶活性,便能反映出基因traI启动子的表达状况。酶活性高,则说明基因traI表达上调。通过该实验观察AHL-SdiA对基因traI的调控情况。结果:①SM10λ π-PA01 进行接合反应。敲除PA01基因lasI、基因rhlI,即AHL的缺失能提高SM10λ π接合频率(P<0.001):若在此基础上,加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干预接合反应,接合频率则降低(P<0.05)。敲除SM10λ π的基因sdiA,能增加SM10λ π-PA01接合频率(P<0.001)。该结果提示,AHL与蛋白SdiA共同抑制SM10λ π接合作用。②SM10λ π-EC600进行接合反应。其中,受体菌EC600为大肠埃希菌,自身不合成AHL。加入AHL干预,接合作用受抑制,SM10λπ-EC600接合频率降低(P<0.001);而在敲除基因sdiA后,接合频率又回复至原水平。但是,在不加AHL干预时,在敲除基因sdiA后,SM10λπ-EC600的接合频率相近。该结果说明,AHL抑制接合作用依赖于基因sdiA的表达。至此,实验从表型上阐明了 AHL-SdiA抑制质粒转移。③SM10λ π-PA01进行接合反应。敲除PA01基因lasI、基因rhlI,即AHL的缺失能上调SM10λ π基因traI表达(P<0.05)。若在此基础上,加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干预接合反应,SM10λ π基因traI表达降低(P<0.05)。敲除SM10λ π的基因sdiA,SM10λ π基因traI表达上调(P<0.05)。该结果从分子上阐明了AHL-SdiA抑制质粒转移。④将含有报告质粒pQ

关键词：铜绿假单胞菌群体感应系统 n-酰基高丝氨酸内酯接合反应 SdiA

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表达yenI基因的APEC重组菌的致病机理研究

表达yenI基因的APEC重组菌的致病机理研究

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作者：张彬彬扬州大学

学位级别：硕士

由禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic ***, APEC)引起的禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是家禽局部或全身性感染的急性或慢性传染性细菌疾病的总称,造成家禽的呼吸道感染和败血症,给养禽业造成了严重的经济损失,成为最严重的细菌... 详细信息

由禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic ***, APEC)引起的禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是家禽局部或全身性感染的急性或慢性传染性细菌疾病的总称,造成家禽的呼吸道感染和败血症,给养禽业造成了严重的经济损失,成为最严重的细菌性传染病之一。随着集约化养禽业的发展,目前在全国大部分省市都报道过此类疾病的爆发。大肠杆菌致病机理和防控研究一直是学术界研究的重要领域和热点课题;大肠杆菌致病性与其自身毒力因子密切直接相关,而这些毒力因子必需共同作用于宿主机体,发挥毒力致病作用,造成机体损害。细菌毒力因子受到严格调控,群体感应系统则参与了这一重要调控过程。本试验研究探析了大肠杆菌群体感应I型系统的相关调控功能,为病原体和机体相互作用的深入研究和大肠杆菌感染的防控提供新颖的理论基础。在细菌生长过程中,能够释放特定信号分子;通过对这些信号分子的感知,细菌可以确定周边环境中的同类数量,并据此调节特定信号分子相关的多种毒力基因;这种现象被称作群体感应(Quorum Sensing),而参与群体感应系统的特定信号分子被称为自体诱导子(Autoinducer, AI)。I型群体感应系统由信号分子合成蛋白和信号分子受体构成,即Luxl和LuxR。事实上,禽源致病性大肠杆菌仅有接受信号分子的SdiA受体蛋白,缺乏Luxl同源蛋白,自身不能合成AHL(n-酰基高丝氨酸内酯)信号分子,只能通过感受环境中其他菌群合成的AHL调控自身毒力。鉴于APEC毒力因子的复杂性,且APEC中I型群体感应系统对细菌毒力调控机制一直未得到阐明。为更好的理解I型群体感应系统功能及APEC发挥毒力作用途径,本研究选择禽源致病性大肠杆菌分离株CE129作为研究对象,将小肠结肠炎耶尔森菌yenl基因克隆入CE129中,赋予其内源合成C6-HSL信号分子的能力,并通过生物报告菌pSB401加以确证。随后利用λ-Red同源重组系统对APEC CE129菌sdiA基因进行敲除,使其缺失感应环境中AHL信号的能力。生长曲线实验表明野生株CE129、重组株CE129/pyenⅠ和缺失株CE129△sdiA与阴性对照株CE129/pBR生长无显著差异;通过体外竞争性试验证明I型QS系统作用下重组株CE129/pyenⅠ与缺失株CE129△sdiA相比并未获得生长优势;通过生物被膜实验,发现CE129在AHL信号作用下生物被膜形成能力显著降低,且进一步通过外源添加梯度浓度C6-HSL信号,确定CE129受AHL信号影响的阈值浓度为84μg/mL;耐药性试验中,AHL影响下CE129对四环素、氯霉素、氧氟沙星和诺氟沙星的抗性没有明显变化;鸡血清杀菌实验,AHL同样未显示出明显调控功能。泳动性试验和鞭毛fliC基因的荧光定量试验结果显示,鞭毛基因fliC并不受AHL信号分子影响,这一现象与EHEC、ETEC等其他血清型大肠杆菌迥异;重组菌CE129/pyenⅠ耐酸性基因gadA的表达比野生株下降37.1%,而耐酸性实验并未显示明显差异,这一结果与猪源、人源致病性大肠杆菌有较大差异。鸡巨噬细胞系HD11细胞吞噬试验和鸡成纤维细胞系DF1细胞黏附试验显示,AHL影响下重组菌巨噬细胞胞内生存能力及黏附能力显著强于野生株,而细菌主要黏附素鞭毛表达无明显变化,Ⅰ型菌毛表达量下降,其对HD11细胞和DF1细胞黏附增强机制尚不明晰。Ⅰ型与Ⅱ型群体感应系统的协同调控关系也受到进一步探索。Ⅱ型QS系统重要基因中,lsrR(QS-Ⅱ受体调控基因)表达量下降46.4%。综上所述,在Ⅰ型群体感应系统影响下,禽源性大肠杆菌CE129的生物被膜形成、抗吞噬能力和粘附能力受到严密调控;进一步确证Ⅰ型QS激活Ⅱ型QS;APEC耐酸性、鞭毛泳动性受AHL调控等现象与ETEC、EHEC存在较大差异。上述结果为进一步探索群体感应系统调控APEC致病机制奠定基础。

关键词：禽源致病性大肠杆菌 Ⅰ型群体感应系统 n-酰基高丝氨酸内酯

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草鱼耐冷特定腐败菌中AHLs类群体信号分泌及姜黄素脂质体抑制作用

草鱼耐冷特定腐败菌中AHLs类群体信号分泌及姜黄素脂质体抑制作用

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作者：陈邦会扬州大学

学位级别：硕士

草鱼(Carperegramen)是我国淡水鱼养殖业主要养殖品种之一,由于其蛋白质丰富、肉质松软和水分含量高等特点,使得草鱼在低温运输过程和鱼肉加工环节大量腐败,造成巨大的经济损失。草鱼在腐败过程中虽然有多种的微生物参与,但只有一到两... 详细信息

草鱼(Carperegramen)是我国淡水鱼养殖业主要养殖品种之一,由于其蛋白质丰富、肉质松软和水分含量高等特点,使得草鱼在低温运输过程和鱼肉加工环节大量腐败,造成巨大的经济损失。草鱼在腐败过程中虽然有多种的微生物参与,但只有一到两种腐败菌会使鱼肉腐败,这种腐败菌被称为特定腐败菌(Specific spoilage organism,SSO),研究表明抑制特定腐败菌的腐败能力可以有效延长草鱼的货架期。在国内外多项研究表明食物特定腐败菌可以产生n-酰基高丝氨酸内酯(n-acyl-L-homoserine ***)来调控生长速率和腐败能力,因此筛选出草鱼中产AHLs的耐冷特定腐败菌并研究其致腐和群体感应能力,通过抑制其群体感应能力以此来延长草鱼货架期是一种新型有效的手段。本文通过分析草鱼在不同温度下的品质变化以及腐败阶段菌落组成结构,分离筛选草鱼的耐冷优势腐败菌,利用紫色杆菌(CV026)筛选具有产AHLs能力的耐冷特定腐败菌,建立HPLC-MS检测方法,定量检测耐冷特定腐败菌分泌的AHLs,制备姜黄素脂质体作用耐冷特定腐败菌,观察对其的抑制作用,为草鱼防腐研究提供一条新思路,主要研究结果如下:1.研究了草鱼在三种不同低温储藏时品质变化以及耐冷优势腐败菌的分离鉴定。草鱼在0℃、4℃和10℃三种低温储藏,随着腐败的进行,淡水鱼的pH值、菌落计数(TAC)、挥发性盐基氮(TVB-n)值和感官评价(QIM)分数均显著上升(pnA,进行16S rDnA测序,其中Aeromonas sp.有13株,占27.66%;Pseudomonas sp.15 株,占 31.91%;Shewaenlla sp.1 1株,占 23.40%;另外还分离得到了Psychrobacter sp.4株,A cinetobactersp.3株,Yersinia sp.1 株。2.筛选耐冷优势腐败菌中具有产AHLs能力的草鱼耐冷特定腐败菌,分析其AHLs分泌种类及含量和对无菌草鱼汁的致腐能力。利用生物报告菌C V026筛选能使其产生紫色色素的耐冷特定腐败菌,由此得到两株产AHLs的耐冷特定腐败菌,*** YZ-CY-03和*** YZ-CY-09。通过 HPLC-MS 检测体系,快速高效地在 9 min内定量检测4种AHLs(R2>0.99),*** YZ-CY-03产C4-HSL能力要远高于*** YZ-CY-09,在培养 48 h 后其分泌量达到 25.73μg/L。***-CY-09在分泌C10-HSL以及C12-HSL含量在培养36 h后达到最高,分别为1.32μg/L和1.51μg/L,要高于*** YZ-CY-03;在无菌鱼汁中接种不同微生物,通过分析腐败过程中的TMA、TVB-n和生物胺变化,比较验证两株产AHLs耐冷特定腐败菌的致腐能力。鱼汁腐败至第10天时,*** YZ-CY-03 和***-CY-09 的 TMA含量分别为 1.70 mg/100mL 和 1.40 mg/100mL,TVB-n 含量分别为 36.84 mg/100mL 和33.66 mg/100mL,*** YZ-CY-03组的色胺、腐胺、尸胺和酪胺显著高于*** YZ-CY-09 组(pnimal Inhibit Concentration)均为 640 mg/L。利用CV026 检测亚抑菌浓度下姜黄素脂质体的抗群体感应活性,320 mg/L的姜黄素脂质体可以明显抑制CV026紫色色素生成;在不影响*** YZ-CY-03与*** YZ-CY-09菌株生长的情况下,姜黄素脂质体能够消除以及抑制*** YZ-CY-03与*** YZ-CY-09的生物被膜,消除率最高为40.65%和51.49%,抑制率最高

关键词：草鱼耐冷特定腐败菌群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯姜黄素脂质体

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转酮醇酶基因在植物感应AHLs中的功能研究

转酮醇酶基因在植物感应AHLs中的功能研究

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作者：王蒙河北工业大学

学位级别：硕士

革兰氏阴性菌分泌信号分子n-酰基高丝氨酸内酯（简称AHLs）。它可以自由进出细菌细胞，细菌通过感知信号分子的浓度来监测自身群体密度，使细菌做出相应的反应来进行调控。而植物也可以感知细菌的AHLs信号分子，并产生包括免疫反应在内... 详细信息

革兰氏阴性菌分泌信号分子n-酰基高丝氨酸内酯（简称AHLs）。它可以自由进出细菌细胞，细菌通过感知信号分子的浓度来监测自身群体密度，使细菌做出相应的反应来进行调控。而植物也可以感知细菌的AHLs信号分子，并产生包括免疫反应在内的应激反应来抵抗病原菌的侵染。本论文通过3H标记的AHLs为探针对拟南芥cDnA文库进行筛选，发现转酮醇酶基因（TK）可能与AHLs相互作用。筛选出基因后就通过两方面来研究在植物感应AHLs中的功能，一方面是构建表达菌株，通过体外表达的蛋白来研究;另一方面是通过突变体与野生型的比较来研究它在植物AHLs中的作用。通过构建表达均菌株，从而得到体外表达的蛋白，通过酶联免疫法（ELISA）证实了转酮醇酶基因的蛋白与信号分子Bio-3OC6-HSL有特异性结合。在植物中，得到tk的突变体，对其进行根长实验和RealTimePCR检测，都证实了TK基因在植物感受信号分子的途径中的重要作用。对TK基因的抗逆性进行研究中，结果表明它在植物抗盐中也起重要作用，而在AHLs和氯化钠共同影响TK的表达的实验表明，TK可以同时参与调控植物感知AHLs和植物的抗逆性。通过比较TK的突变体植株的MAPK的蛋白表达，蛋白磷酸化，以及基因的表达与野生型里MAPK的蛋白表达，蛋白磷酸化，以及基因的表达的异同，确定了TK在感知信号分子的过程中与MAPK途径有关，初步了解TK途径影响植物感受信号分子的机理。

关键词： n-酰基高丝氨酸内酯转酮醇酶基因 Real Time PCR 抗逆性 MAPK

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AHL酶基因的克隆及序列分析

AHL酶基因的克隆及序列分析

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作者：王艳敏河北工业大学

学位级别：硕士

以马铃薯为实验材料,对病原菌萝卜E.C.C的致病能力进行验证分析。确定实验用量为50μl菌悬液。具体分析相同吸光度下每毫升病原菌和拮抗菌芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的菌液中所含菌落数。结果表明,相同吸光度下不同菌种的每毫升菌液中含... 详细信息

以马铃薯为实验材料,对病原菌萝卜E.C.C的致病能力进行验证分析。确定实验用量为50μl菌悬液。具体分析相同吸光度下每毫升病原菌和拮抗菌芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的菌液中所含菌落数。结果表明,相同吸光度下不同菌种的每毫升菌液中含大致相同的菌数。然后利用马铃薯作为试验材料对现有的菌种进行筛选,得到结果是对病原菌抑制作用较好的是苏云金芽孢杆菌鲇泽变种ACCC10016,想利用农杆菌试验进一步证明所选菌种,结果没能如愿。抑病试验证明芽孢杆菌Bt4和苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314中含有水解AHLs的水解酶——AHLs水解酶。其中,Bt4和病原菌萝卜E.C.C的菌落个数比为2:15,苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314和病原菌萝卜E.C.C的菌落个数比为3:15时,就能很好的抑制病原菌对马铃薯的侵染。分别提取芽孢杆菌的基因组DnA,和载体的质粒DnA。根据文献发表的基因序列设计特异性引物,以芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的基因组DnA为模板进行PCR扩增,得到两个大小约为800bp的PCR产物,它们分别来自于Bt4和苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314。回收PCR产物,命名为SS1和SS10。核苷酸序列分析表明,所扩增的两个基因片段大小均为753bp,和基因库中已知的AHLs酶 n-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiA的同源性达96%以上,其活性部位为“HFDH～H～D”。和其他一些苏云金芽孢杆菌比较,同源性高达98%,其中的活性催化中心为His119,His188和Asp210。构建融合表达载体pGEX-SS1和pGEX-SS10,用IPTG对融合蛋白进行诱导表达,琼脂糖凝胶电泳结果表明,其大小为55KDa。然后利用亲和柱层析法纯化融合蛋白。

关键词： n-酰基高丝氨酸内酯水解酶 PCR克隆 AHLs水解酶

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植物对细菌群体感应系统的反应

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细胞生物学杂志 2005年第4期27卷 427-430页

作者：宋水山贾振华邢志华马宏高振贤张霞河北省生物研究所保定市农业科学研究所保定071001

细菌的群体感应系统参与包括动植物病原细菌致病因子产生在内的许多生物学功能的调节。植物可以感知细菌群体感应系统及其信号分子,并作出复杂反应。植物可能受细菌群体感应信号分子诱导产生系统性防御反应,能够分泌细菌群体感应信号分... 详细信息

细菌的群体感应系统参与包括动植物病原细菌致病因子产生在内的许多生物学功能的调节。植物可以感知细菌群体感应系统及其信号分子,并作出复杂反应。植物可能受细菌群体感应信号分子诱导产生系统性防御反应,能够分泌细菌群体感应信号分子的类似物,可能产生降解细菌n-酰基高丝氨酸内酯信号分子的酶来阻断或干扰细菌群体感应系统。

关键词：细菌群体感应系统植物抗病性 n-酰基高丝氨酸内酯植-微生物相互作用植物病原细菌细菌群体感应系统复杂反应信号分子群体感应

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新洋葱伯克氏菌中一种AraC型转录调控蛋白调控机制研究

新洋葱伯克氏菌中一种AraC型转录调控蛋白调控机制研究

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作者：黄钰童华南农业大学

学位级别：硕士

群体感应(Quorum sensing QS)机制被广泛运用于细菌间信息交流,参与调控细菌生物膜形成、运动性、致病毒力等多种生物学功能。新洋葱伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)是一种常见的人体条件性致病菌,常感染肺囊肿性纤维化和免疫力缺... 详细信息

群体感应(Quorum sensing QS)机制被广泛运用于细菌间信息交流,参与调控细菌生物膜形成、运动性、致病毒力等多种生物学功能。新洋葱伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)是一种常见的人体条件性致病菌,常感染肺囊肿性纤维化和免疫力缺陷患者,在***中,存在两种主要类型的QS系统,分别为顺式-2-十二烯酸信号系统(BDSF系统)和n-酰基高丝氨酸内酯信号系统(AHL系统),两种QS系统共同参与调控多种生物学功能。目前,关于QS系统相关调控机制研究较多,但最近的证据表明,QS系统也受其他调控因子的调控,如双组分系统、Ara C型转录调控因子等多种因子。其中Ara C超家族转录调控因子,在多种细菌中被证实可调控毒力与应激反应,更是在绿脓杆菌中证实可调控QS信号的产生。本课题便是基于此研究背景下,筛选鉴定出一个Ara C超家族转录调控因子atr A(Arac-type transcription regulate AHL),并对其生物学功能和调控机制进行了详细研究。通过对atr A突变体进行的表型检测,发现基因atr A的缺失能够造成***生物膜合成显著下降、运动能力变弱,以及细胞侵染毒力减弱等多方面生物学功能的降低,其互补体能较好恢复至野生型水平。随后在基因转录表达检测中发现,在Δatr A中AHL信号合成酶编码基因cep I的表达显著下调,BDSF信号合成酶编码基因rpf F上调表达,受QS信号调控的目标基因簇bcl ACB上调表达。同时通过对QS信号定量分析,在Δatr A中AHL信号产量显著降低,同时信号BDSF产量部分增加。为研究Atr A对QS系统的调控方式,在随后的电泳迁移率实验(EMSA)实验中表明蛋白Atr A能够直接结合到cep I启动子区调控AHL信号合成酶编码基因的表达,从而影响受AHL系统所调控的生物学功能,并且通过Dnase I footprinting途径确定了cep I启动子区域结合碱基序列为GCG CGC TGT AAT GCA CGC ATA CAAAAG CAC AGA TCCG。此外,利用RnA-Seq技术对atr A和cep I突变体中差异表达基因进行分析,发现Atr A调控蛋白和AHL系统所调控的目标基因存在大量重叠。atr A和cep I突变体也表现出相似的生物学表型缺陷,包括生物膜产量显著降低、运动活性减弱、QS信号产量降低、细胞侵染毒力减弱等现象。同时,我们也发现atr A基因位点附近的bcam0582能够影响受QS系统所调控的目的基因簇bcl ACB。其突变体中基因簇bcl ACB的表达出现显著性上调,同时细胞侵染毒力作用有所增强。综上所述,Ara C超家族转录调控因子Atr A能够调控***的QS信号合成,并能直接调控目标基因的转录水平。atr A位点临近基因bcam0582被证明也能够影响bcl ACB基因簇转录表达水平,但其具体调控机制尚不清晰,还需进一步的研究与探索。

关键词：新洋葱伯克氏菌 AraC型转录调控蛋白群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯洋葱伯克氏菌扩散信号分子

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牙鲆肠弧菌密度感应系统的研究及其信号分子降解菌株的筛选

牙鲆肠弧菌密度感应系统的研究及其信号分子降解菌株的筛选

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作者：李轩中国海洋大学

学位级别：硕士

密度感应(Quorum Sensing)是细菌监控自身群体密度的环境信号感受系统。细菌在繁殖过程中分泌一些特定的化学信号分子,这种信号分子从胞内扩散到胞外,当这种信号分子达到一定的阈值时,细菌感受到自身的细胞密度,启动某些基因的表达,这... 详细信息

密度感应(Quorum Sensing)是细菌监控自身群体密度的环境信号感受系统。细菌在繁殖过程中分泌一些特定的化学信号分子,这种信号分子从胞内扩散到胞外,当这种信号分子达到一定的阈值时,细菌感受到自身的细胞密度,启动某些基因的表达,这一过程称为密度感应。目前,已在许多革兰氏阳性菌和阴性菌中发现了密度感应系统,并调控许多基因的表达。已有研究证实了一些病原性弧菌通过自身复杂的密度感应系统来调控致病因子的表达。本研究使用了报告菌株根癌农杆菌KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410),检测发现牙鲆肠弧菌DA3有三种不同的酰基高丝氨酸内酯类自诱导分子(acyl-homoserine lactone, AHLs)。由于这三种AHL信号分子不可以被报告菌株紫色杆菌CV026检测出来,我们推测它们可能有着较长的n-酰基侧链或者特殊的侧链基团,例如羟基侧链基团。它们的结构性质目前仍旧未知,需要通过HPLC-MS分析进行更进一步的研究。DA3在整个生长阶段都产生AHL信号分子,其活性随着细菌的密度增加而增强。DA3也可产生AI-2类自诱导分子(autoinducer-2,AI-2);AI-2信号分子在对数生长期开始积累并迅速达到一定的活性水平,并且保持在这一较高的活性水平直到细菌生长的稳定期。本研究进一步克隆了DA3 luxS基因的全长序列并发现其与大菱鲆弧菌的luxS基因有99.6%的相似性。luxS基因突变株M-2丧失产生AI-2信号分子的能力,生长率和生物膜的产生均未受到影响,且未显著影响牙鲆肠弧菌的致病性。所有数据表明,luxS基因与牙鲆肠弧菌的致病性没有直接的调控关系,或者牙鲆肠弧菌的致病性是由其它不同的密度感应系统协同调控,仅失去luxS基因的调控并不能降低其致病性。牙鲆肠弧菌DA3与其标准菌株LMG19664T都不产生霍乱弧菌Ⅰ类自体诱导分子(cholerae autoinducer-1,CAI-1)。已报道AHL介导的密度感应系统存在参与弧菌病原菌毒力的调控,如哈维氏弧菌,鳗弧菌等,因此干扰AHL介导的密度感应系统是一种新的抗感染策略。研究表明芽孢杆菌产生的AiiA酶,可水解AHLs的乙酰链、高丝氨酸内脂的氨基键或内酯环的酯键,而使AHLs失活。本研究从自然海区分离了37株芽孢杆菌菌株,筛得5株对Da3具有较强AHL降解活性的菌株,为下一步在鱼体内拮抗牙鲆肠弧菌提供了理论依据。这是关于牙鲆肠弧菌密度感应系统的首次研究。

关键词：牙鲆肠弧菌 n-酰基高丝氨酸内酯 AI-2 CAI-1 luxS突变 AHL降解

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