AHL-SdiA抑制大肠埃希菌质粒转移

作     者：伍彬宁 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈茶

授予年度：2017年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：铜绿假单胞菌 群体感应系统 N-酰基高丝氨酸内酯 接合反应 SdiA 

摘      要：目的:质粒转移是细菌传播耐药基因的重要途径。质粒(plasmid)是的环形DNA,它不仅独立于细菌染色体,而且能自主复制。部分质粒具有转移性,并能携带抗生素耐药基因。广泛宿主质粒能穿梭于细菌间,因此质粒被视为传播耐药的关键媒介。质粒水平转移的主要途径是细菌的接合作用。接合作用(conjugation)是细菌借助性菌毛相互沟通、传受DNA的过程。因此,细菌接合作用被视为传播抗生素耐药基因的重要途径。AHL是细菌群体感应系统的信号分子。群体感应(quorum sensing,QS)是细菌感知群体数量变化,并调整群体行为的调控系统。其中,脂肪酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine lactones,AHL)是革兰阴性菌QS系统的信号分子,它通过结合LuxR类受体蛋白,实现调控基因表达。蛋白SdiA是QS系统的受体蛋白,同时也是重要的转录因子。蛋白SdiA存在于大肠埃希菌中,能感知并结合其他细菌分泌的AHL。蛋白SdiA拥有DNA结合域,它能结合基因的启动子,以调控基因表达。因此,QS系统通过AHL-SdiA调控基因表达。一般认为,质粒转移的调控是由质粒与宿主共同调控的过程,而受体菌参与接合调控则少有报道。本文推测,受体菌能通过QS系统调控质粒转移:受体菌分泌AHL,通过与宿主的蛋白SdiA结合,两者形成复合物,以调控接合相关基因traI。其中,蛋白TraI能结合质粒复制起始点oriT,参与质粒的复制及转移全过程,直接调控细菌接合作用。因此,本文探究AHL-SdiA与基因traI的调控关系。另外,本文发现蛋白SdiA对sRNA的调控作用,展望后续研究AHL-SdiA-sRNA对细菌接合作用的调控机制。方法:本实验采用大肠埃希菌SM10λπ作为质粒供体菌。该菌染色体被整合了质粒转移的调控元件(包含基因traI),并含有转移性质粒pUC24T。质粒pUC24T具庆大霉素(Gm)抗性,作为候选实验的筛选标记。受体菌则选用铜绿假单胞菌PA01。PA01基因IasI、基因rhlI分别调控3-oxo-C12-HSL、C4-HSL的催化合成,后两者为PA01最主要的AHL。实验主要通过构建接合模型、运用荧光定量PCR(qPCR)检测基因表达量以及启动子报告质粒来验证实验假设。构建接合模型。分别将供、受体菌培养至0.5麦氏浊度单位(MCF)。利用尿液分析仪测细菌浓度,并调配菌液浓度至1.0×107CFU/mL。供、受体菌各取100μL,37℃混合培养6h。筛选合子并计数,换算接合频率。接合频率高,则说明接合作用则强。qPCR检测基因表达量。收集待测菌液,并抽提细菌全RNA组。将RNA反转录为cDNA。以cDNA作为模板,利用qPCR检测目的基因相对表达量。构建基因traI启动子报告质粒pQF50-PtraI。以质粒pQF50为载体,该质粒缺少Laz启动子。运用分子克隆技术,将基因traI启动子及其上游317 bp片段,克隆于β-半乳糖苷酶基因上游。当基因traI启动子被激活时,其下游β-半乳糖苷酶基因也被激活。后续通过β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)检测酶活性,便能反映出基因traI启动子的表达状况。酶活性高,则说明基因traI表达上调。通过该实验观察AHL-SdiA对基因traI的调控情况。结果:①SM10λ π-PA01 进行接合反应。敲除PA01基因lasI、基因rhlI,即AHL的缺失能提高SM10λ π接合频率(P0.001):若在此基础上,加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干预接合反应,接合频率则降低(P0.05)。敲除SM10λ π的基因sdiA,能增加SM10λ π-PA01接合频率(P0.001)。该结果提示,AHL与蛋白SdiA共同抑制SM10λ π接合作用。②SM10λ π-EC600进行接合反应。其中,受体菌EC600为大肠埃希菌,自身不合成AHL。加入AHL干预,接合作用受抑制,SM10λπ-EC600接合频率降低(P0.001);而在敲除基因sdiA后,接合频率又回复至原水平。但是,在不加AHL干预时,在敲除基因sdiA后,SM10λπ-EC600的接合频率相近。该结果说明,AHL抑制接合作用依赖于基因sdiA的表达。至此,实验从表型上阐明了 AHL-SdiA抑制质粒转移。③SM10λ π-PA01进行接合反应。敲除PA01基因lasI、基因rhlI,即AHL的缺失能上调SM10λ π基因traI表达(P0.05)。若在此基础上,加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干预接合反应,SM10λ π基因traI表达降低(P0.05)。敲除SM10λ π的基因sdiA,SM10λ π基因traI表达上调(P0.05)。该结果从分子上阐明了AHL-SdiA抑制质粒转移。④将含有报告质粒pQ