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胸膜肺炎放线杆菌n-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶的表达及抑制剂筛选

胸膜肺炎放线杆菌N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶的表达及抑制...

引用

作者：郝志香华中农业大学

学位级别：硕士

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是引起的,给世界养猪业带来了严重经济损失。UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-n-acetylglucosamine, UDP-GlcnAc)是病原菌细胞壁碳水化合物合成的必须前体,如肽聚糖、脂质A、磷壁酸等,由双功能酶n-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶(n-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase, GlmU)催化1-磷酸葡萄糖胺(glucosamine-1-phosphate, Glcn-1-P)、乙酰辅酶A和UTP经过两步反应生成。如果干扰UDP-GlcnAc合成路径将严重阻碍细菌的生长并影响其毒力,因此GlmU是一个重要的药物靶标。为了对GlmU先导化合物活性进行研究,对GlmU蛋白的酶促动力学分析是非常必要的。本论文主要对胸膜肺炎放线杆菌GlmU蛋白进行了研究,主要成果如下：1. glmU基因的克隆表达与纯化根据nCBI Genebank中提供的胸膜肺炎放线杆菌血清3型JL03菌株全基因组序列设计引物。以胸膜肺炎放线杆菌JL03基因组为模板,采用PCR方法扩增了glmU基因,将其克隆到了pET-28a表达载体上,并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中进行了高效表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明重组蛋白与预期分子量大小一致(50 KD),该蛋白的成功纯化为下一步的研究奠定了良好基础。2. GlmU尿苷酰转移酶酶促动力学分析采用孔雀石绿钼酸铵显色法测定了GlmU尿苷酰转移酶的初速度,确定了其最佳阳离子表面活性剂是聚乙烯醇(PVA),最佳检测波长为630 nm,最佳反应温度为37℃,最佳反应时间为5 min,最佳反应pH值为7.6,并在最佳反应条件下测定了其酶促动力学常数：对于底物GlcnAc-1-P, GlmU的Km值为0.05478 mM,最大速率Vmax为0.00370 mMmin-1,对于底物UTP, GlmU的Km值为0.06608 mM,最大速奎Vmax为0.00371 mM min-13. GlmU抑制剂的初步筛选运用上述酶活测定体系评估了计算机虚拟筛选的44个先导化合物,得到了8个效果较好的抑制剂,分别对这8个先导化合物进行了抑制常数和IC50的测定,为进一步研究其抑制作用机理和研制新的药物奠定了基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 n-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶酶促动力学先导化合物抑制常数(Ki)

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基于沙门氏菌FabI和黄单胞菌GlmU结构的靶酶抑制剂筛选

基于沙门氏菌FabI和黄单胞菌GlmU结构的靶酶抑制剂筛选

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作者：闵军华中农业大学

学位级别：硕士

传统的药物设计和研发耗资大、周期长且效率低;计算机辅助药物设计的发展大大减少了药物研发中的资金投入,降低了寻找新药的盲目性和偶然性,缩短了药物研发的周期。本研究借助计算机辅助药物设计方法进行了基于肠炎沙门氏菌（Salmonella... 详细信息

传统的药物设计和研发耗资大、周期长且效率低;计算机辅助药物设计的发展大大减少了药物研发中的资金投入,降低了寻找新药的盲目性和偶然性,缩短了药物研发的周期。本研究借助计算机辅助药物设计方法进行了基于肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）烯酰-ACP还原酶（enoyl-ACP reductase, EnR）和水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）n-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶（n-Acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase, GlmU）结构的靶酶抑制剂筛选。 S. enterica是导致食源性疾病爆发的的主要病原菌,严重影响公众的安全。脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis, FAS）为细菌生物膜的形成提供必需的前体,在细菌生物膜的形成过程中起着不可替代的作用。EnRs作为催化FAS的关键酶,是一个非常理想的药物筛选靶标。本研究进行了基于S. enterica EnR （SeFabI）结构的抑制剂的虚拟筛选和研究：中药小分子luteolin,对SeFabI抑制效果较好的,IC50为15.6±0.5μmol/L。抑制动力学显示luteolin是底物crotonyl-CoA的反竞争性的抑制剂,抑制常数为15.1±0.3μmol/L。克隆表达了SeFabI[G93V]、SeFabI[G93S]和SeFabI[Y156F]三个突变酶来研究luteolin对SeFabI的抑制机理。SeFabI[G93V]和SeFabI[G93S]催化活性与野生型相比没有明显的差别,而SeFabI[Y156F]则完全失去了催化活性;与野生型相比,SeFabI[G93V]对triclosan和luteolin都显示了较高的抗性;SeFabI[G93S]对triclosan显示较高的抗性,而对luteolin的抑制更敏感。luteolin是从植物中提取的中药成分,其具有高效、低毒性等特性,是一个很好的SeFabI靶酶抑制剂先导化合物,值得进一步研究。由X. oryzae pv. oryzae引起的细菌白叶枯病是造成水稻大量减产的一种最主要的原因。关于glmU基因敲除的报道表明GlmU是细菌细胞壁合成的关键酶,是研发全新抗生素药物的一个很具有吸引力的新靶标。本研究中定点突变及酶活性测试显示Gly13、Arg17、Lys24和Asp105为XooGlmU活性位点的关键氨基酸;并在此基础上进行了基于XooGlmU结构的抑制剂的虚拟筛选和研究;筛选到对XooGlmU抑制效果较好的4个化合物,IC50值在0.5-10μmol/L范围内。抑制动力学表明,这4个化合物都是底物GlcnAc-1-P的竞争性抑制剂,是底物UTP的反竞争性抑制剂,抑制常数最小可达0.2μmol/L。3号和4号化合物对X. oryzae pv. oryzae具有较好的抑菌效果,MIC值分别为75和5μg/mL。这是首次筛选到既能抑制GlmU,而且又具有抑菌效果的小分子化合物。本研究结果为GlmU抑制剂的进一步研究提供了很好的化合物结构骨架。

关键词：肠炎沙门氏菌水稻黄单胞菌烯酰-ACP还原酶 n-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶酶抑制剂

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