胸膜肺炎放线杆菌N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶的表达及抑制剂筛选

作     者：郝志香 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周锐

授予年度：2011年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：胸膜肺炎放线杆菌 N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶 酶促动力学 先导化合物 抑制常数(Ki) 

摘      要：猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是引起的,给世界养猪业带来了严重经济损失。UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine, UDP-GlcNAc)是病原菌细胞壁碳水化合物合成的必须前体,如肽聚糖、脂质A、磷壁酸等,由双功能酶N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase, GlmU)催化1-磷酸葡萄糖胺(glucosamine-1-phosphate, GlcN-1-P)、乙酰辅酶A和UTP经过两步反应生成。如果干扰UDP-GlcNAc合成路径将严重阻碍细菌的生长并影响其毒力,因此GlmU是一个重要的药物靶标。为了对GlmU先导化合物活性进行研究,对GlmU蛋白的酶促动力学分析是非常必要的。本论文主要对胸膜肺炎放线杆菌GlmU蛋白进行了研究,主要成果如下： 1. glmU基因的克隆表达与纯化 根据NCBI Genebank中提供的胸膜肺炎放线杆菌血清3型JL03菌株全基因组序列设计引物。以胸膜肺炎放线杆菌JL03基因组为模板,采用PCR方法扩增了glmU基因,将其克隆到了pET-28a表达载体上,并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中进行了高效表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明重组蛋白与预期分子量大小一致(50 KD),该蛋白的成功纯化为下一步的研究奠定了良好基础。 2. GlmU尿苷酰转移酶酶促动力学分析 采用孔雀石绿钼酸铵显色法测定了GlmU尿苷酰转移酶的初速度,确定了其最佳阳离子表面活性剂是聚乙烯醇(PVA),最佳检测波长为630 nm,最佳反应温度为37℃,最佳反应时间为5 min,最佳反应pH值为7.6,并在最佳反应条件下测定了其酶促动力学常数：对于底物GlcNAc-1-P, GlmU的Km值为0.05478 mM,最大速率Vmax为0.00370 mMmin-1,对于底物UTP, GlmU的Km值为0.06608 mM,最大速奎Vmax为0.00371 mM min-1 3. GlmU抑制剂的初步筛选 运用上述酶活测定体系评估了计算机虚拟筛选的44个先导化合物,得到了8个效果较好的抑制剂,分别对这8个先导化合物进行了抑制常数和IC50的测定,为进一步研究其抑制作用机理和研制新的药物奠定了基础。