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猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备

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畜牧与兽医 2023年第2期55卷 67-72页

作者：刘磊何颖陈忠伟赵武段群棚赵硕梁家幸周英宁全琛宇许心婷陈婷婷许艺兰李斌蒋冬福卢敬专秦毅斌卢冰霞广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001 广西农业职业技术大学广西南宁530007

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)n蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-n,将pET32a-n转化至大肠杆菌BL21... 详细信息

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)n蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-n,将pET32a-n转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组n蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组n蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示:重组n蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组n蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组n蛋白具有较好免疫原性。提示:PDCoV n蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原。

关键词：猪丁型冠状病毒 N基因原核表达多克隆抗体抗原性分析

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三株美洲驼源狂犬病病毒N基因遗传进化分析

野生动物学报 2021年第1期42卷 120-123页

作者：王金玲郑秉武曹霞杨龙峰葛金英卢爱桃内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010010 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010010 呼和浩特市园林管理局动物园管理处呼和浩特010050 北京市延庆区动物疫病预防控制中心北京102100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 内蒙古自治区综合疾病预防控制中心呼和浩特010031

为阐明2015年在内蒙古呼和浩特地区3株美洲驼源狂犬病病毒(RABV)流行株的遗传进化情况,经基因扩增和测序获得3株美洲驼源RABV N基因序列,并进行遗传进化分析。结果显示3株RABV之间N基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为100%,且都与201... 详细信息

为阐明2015年在内蒙古呼和浩特地区3株美洲驼源狂犬病病毒(RABV)流行株的遗传进化情况,经基因扩增和测序获得3株美洲驼源RABV N基因序列,并进行遗传进化分析。结果显示3株RABV之间N基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为100%,且都与2011年呼和浩特奶牛源和犬源毒株、2013年内蒙古牛源毒株、2007年湖北犬源毒株、2016和2018年北京犬源毒株、2006年天津犬源毒株和2009年福建犬源毒株的亲缘性最高,同源率为100%。这些毒株位于同一个遗传进化群内,均属于CTn-1(Asian谱系)。研究结果说明3株美洲驼源RABV的N基因与参考的内蒙古、湖北、北京、福建和天津毒株起源于共同的祖先。

关键词：美洲驼狂犬病病毒 N基因遗传进化

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小反刍兽疫病毒N基因部分序列分子演化规律

中国兽医学报 2017年第12期37卷 2304-2309页

作者：王净王鹏王长顺河北北方学院动物科技学院河北张家口075131 河北北方学院农林科技学院河北张家口075131

为分析中国小反刍兽疫的流行特点,本研究采用生物信息学方法,从nCBI下载小反刍兽疫病毒(PPRV)N基因,以最大似然法建立分子进化树。结果显示,中国PPRV流行株分布于Ⅳ系,有2个分支,2007-2008年中国西藏流行株与2003年印度毒株遗传关系最近... 详细信息

为分析中国小反刍兽疫的流行特点,本研究采用生物信息学方法,从nCBI下载小反刍兽疫病毒(PPRV)N基因,以最大似然法建立分子进化树。结果显示,中国PPRV流行株分布于Ⅳ系,有2个分支,2007-2008年中国西藏流行株与2003年印度毒株遗传关系最近,2013-2015年中国西藏流行株与2012年巴基斯坦毒株遗传关系最近。中国小反刍兽疫主要发生于山羊,2015年新疆巴州毒株来自阿尔卑斯野山羊,与2013年以来的毒株在同一分支。China-BJ_2014与China-XJBZ_2015的遗传距离为0.011 7。中国两簇PPRV分支均与西部邻国毒株遗传关系最近,目前出现多宿主和变异性的流行特点,本研究为有效防控PPRV疫情提供基本的科学依据。

关键词： PPRV N基因分子进化树最大似然法遗传距离

广西部分地区猪群PEDV N基因克隆及序列分析

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西南农业学报 2018年第2期31卷 409-414页

作者：许瑞胜何奇松李春英冯淑萍易春华韦达有胡丽萍黄胜斌胡巧云熊毅马琳广西动物疫病预防控制中心广西南宁530001 钦州市动物疫病预防控制中心广西钦州535000 桂林市动物疫病预防控制中心广西桂林541002

【目的】了解广西区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染及病毒的遗传变异特点,为更好防控猪流行性腹泻提供科学依据。【方法】应用RT-PCR方法从2012-2016年广西地区25个猪场收集的PEDV病料中扩增出86株PEDV的N基因,并进行序列比对及遗传进化... 详细信息

【目的】了解广西区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染及病毒的遗传变异特点,为更好防控猪流行性腹泻提供科学依据。【方法】应用RT-PCR方法从2012-2016年广西地区25个猪场收集的PEDV病料中扩增出86株PEDV的N基因,并进行序列比对及遗传进化分析。【结果】86株PEDV的N基因核苷酸同源性为94.2%~100.0%,与参考毒株核苷酸同源性为94.1%~100.0%。N基因遗传进化分析显示广西的PEDV可分为2个群,Cluster2由韩国株DR13、日本株83P-5、中国株CH/S以及本研究的GP35-8、LC37-22、LC107-5、LC107-19和LC107-16毒株组成,其他81株毒株属于Cluster 3,包括中国株DX、LJB-03、Hu n、JS-2004-2;Cluster 1和Cluster 4则由其它参考毒株组成。【结论】PEDV是引起广西规模化猪场新生仔猪腹泻的主要病原,广西地区的PEDV流行毒株可分为2个群且其N基因仍然保守。

关键词：猪流行性腹泻病毒 N基因序列分析遗传进化分析

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

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动物医学进展 2020年第2期41卷 23-28页

作者：张云飞袁一心崔新格李倩魏战勇河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因... 详细信息

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。

关键词：猪流行性腹泻病毒 ORF3基因 N基因遗传进化分析

变异猪流行性腹泻病毒M和n双基因融合真核表达及其活性鉴定

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南方农业学报 2020年第12期51卷 3083-3089页

作者：王隆柏陈秋勇吴学敏陈如敬车勇良周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013

【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-n双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过... 详细信息

【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-n双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-n双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-n双基因融合蛋白。通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性。【结果】扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%。将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-n双基因融合重组质粒,M-n双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%。以pM2-M-n双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-n双基因融合蛋白,纯化的M-n双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体。【结论】通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-n融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-n双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV) M基因 N基因双基因融合蛋白

PPRV武威分离株N基因的原核表达及免疫原性分析

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农业生物技术学报 2019年第8期27卷 1478-1484页

作者：王雯包世俊邢小勇胡荣斌丁小琴伏小平薛慧文甘肃农业大学动物医学院

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性传染病,严重危害世界养羊业的健康发展。2013年以来,国内多地出现小反刍兽疫疫情,给我国养羊业造成了重大经济... 详细信息

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性传染病,严重危害世界养羊业的健康发展。2013年以来,国内多地出现小反刍兽疫疫情,给我国养羊业造成了重大经济损失。本研究根据小反刍兽疫病毒nigeria 75/1株N基因核苷酸序列(GenBank no. HQ197753)设计特异性引物,扩增获得PPRV武威分离株N基因全序列(GenBank no. KY429031),在序列分析的基础上,构建该基因的原核表达载体pET-PPRV-n,并将其转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)后诱导表达。纯化表达产物,免疫Balb/C小鼠(Mus musculus)制备多克隆抗体,进而应用ELISA、Western blot和免疫荧光检测(immunological fluorescence assay, IFA)对PPRV n蛋白的免疫原性进行分析。结果表明,PPRV武威分离株属于Ⅳ系,且其N基因全序列与国内24株PPRV分离株及2016蒙古株的同源性高达99.0%;重组蛋白His-PPRV-n在大肠杆菌Rosetta (DE3)中成功获得表达,其相对分子质量约为57.8 kD,且主要以可溶性形式存在;ELISA、Western blot及IFA结果显示,重组蛋白小鼠多抗ELISA效价可达1∶64 000,可与PPRV疫苗株或武威分离株的n蛋白特异性结合,且制备的多抗显示出对PPRV明显的中和作用,表明了重组蛋白良好的免疫原性。本研究结果为PPRV检测方法的建立和n蛋白生物学功能的进一步研究提供了基础资料。

关键词：小反刍兽疫病毒(PPRV) N基因原核表达免疫原性

猪传染性胃肠炎病毒M、N基因重组杆状病毒的构建及其口服免疫小鼠诱导抗体水平测定

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中国兽医学报 2015年第1期35卷 5-10页

作者：宋振辉卿家超冷勇买买提.艾孜子齐晓娟叶翠芳西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)M和n结构蛋白基因,将其分别克隆入载体FastBacTM Dual,获得转移质粒pFastBacTM Dual-M和pFastBacTM Dual-n,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-M和Bacmid-n;在Cellfection作用下,将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-M和rBac-n。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明,杆状病毒表达的M蛋白和n蛋白能够被特异性阳性血清识别,重组蛋白具有较好的反应原性。将重组杆状病毒rBac-M和rBac-n口服免疫小鼠,收集小鼠粪便检测抗TGEV sIgA抗体水平,采集血液检测血清中抗TGEV IgG。结果显示,重组杆状病毒(rBac-M和rBac-n)可诱导小鼠产生粘膜免疫和体液免疫应答。试验结果初步预示了杆状病毒经口服途径作为抗原递呈载体的可行性,也为开展TGEV口服免疫研究奠定了基础。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) M基因 N基因口服免疫抗体

2株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定与S1、M和N基因序列分析

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中国兽医杂志 2021年第1期57卷 10-14页

作者：何家辉封柯宇李鸿鑫宋才良张钰坤谢青梅华南农业大学动物科学学院广东广州510642

为跟踪了解广东地区鸡传染性支气管炎病流行情况,2019年从广东省清远、惠州两地疑似鸡传染性支气管炎发病鸡群中采集分离到2株传染性支气管炎病毒,并对其进行了鉴定和分析。结果显示,在鸡胚上盲传3代后均出现鸡胚的典型病变,死亡鸡胚全... 详细信息

为跟踪了解广东地区鸡传染性支气管炎病流行情况,2019年从广东省清远、惠州两地疑似鸡传染性支气管炎发病鸡群中采集分离到2株传染性支气管炎病毒,并对其进行了鉴定和分析。结果显示,在鸡胚上盲传3代后均出现鸡胚的典型病变,死亡鸡胚全身出血明显,未死亡鸡胚发育受阻,呈明显的侏儒胚、蜷缩。将2个分离株分别命名为CK/CH/GD/QY1119和CK/CH/GD/HZ1225,分别测定其半数感染量(EID 50),扩增其S 1、M和N基因核苷酸序列,获得相应的推导氨基酸序列并对其分析。分离株CK/CH/GD/QY1119和CK/CH/GD/HZ1225的EID 50分别为10-7.5/0.1 mL和10-6.75/0.1 mL,2个分离株S 1基因与Mass型等疫苗株同源性为76.2%~82.1%,同源性均较低。与H120疫苗株相比,2个分离株的S 1、M和N基因存在若干氨基酸的差异,2个分离株S 1基因均存在氨基酸的插入,分离株CK/CH/GD/QY1119的M基因存在氨基酸的缺失,分离株CK/CH/GD/HZ1225的M基因存在氨基酸的插入。进化树分析显示,2个分离株分别属于LDT3型分支和QX型分支,均在S 1、M和N基因进化树上的分属上存在差异。结果表明本次分离得到的2个分离株的S 1、M和N基因均存在不同程度变异,在临床防控中应引起重视。本试验为鸡传染性支气管炎的有效防控提供了参考依据。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 LDT3型 QX型 S 1基因 M基因 N基因序列分析