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meis2基因调控结直肠癌细胞的干性和奥沙利铂化疗耐药性的作用及其分子机制研究

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MEIS2基因调控结直肠癌细胞的干性和奥沙利铂化疗耐药性的作用及...

作者：邱振伦福建医科大学

学位级别：硕士

结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是目前最常见的胃肠道恶性肿瘤之一,结直肠癌的标准化发病率和死亡率在过去几年中不断上升,这主要归因于复发和远处器官转移,而导致复发的主要原因是化疗耐药,从而导致生存率下降。有研究报道,化疗耐药... 详细信息

结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是目前最常见的胃肠道恶性肿瘤之一,结直肠癌的标准化发病率和死亡率在过去几年中不断上升,这主要归因于复发和远处器官转移,而导致复发的主要原因是化疗耐药,从而导致生存率下降。有研究报道,化疗耐药性的形成,与肿瘤细胞的干细胞样特性和化学治疗不敏感有很大关系。目前标准治疗方案为手术结合化疗。2019年NCCN指南推荐的化疗一线方案是以含有奥沙利铂为主的FOLFOX、Cape OX方案,目前临床上仍有部分病人对此方案不敏感,故进一步研究结直肠癌形成干性及耐药性而导致复发可能的分子机制可为临床上诊疗结直肠癌,提供逆转耐药实现精准化疗。MYELOID ECTOPIC VIRAL INTEGRATION SITE(meis)蛋白包括meis1,meis2,和meis3等三种类型,在全基因组范围内,主流观点认为meis蛋白作为HOX蛋白的辅助因子,它们都含有一个非典型的DNA结合域和启动子区域,形成DNA蛋白复合物,进而影响其在细胞中的作用。其中MESI2已有被证实涉及到人类癌症的发病机制中,meis2蛋白表达和功能的异常与多种癌症相关,其所发挥的致癌和抑癌作用取决于不同的器官部位,比如,meis2的高表达与卵巢癌患者的预后改善有关,而在神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌中,其高表达促进肿瘤发生,并且与其发生转移性疾病相关。然而,meis2在CRC中的功能作用仍不清楚。本课题组在前期通过WGCNA等方法得出该基因在结直肠癌中可能抑制肿瘤细胞增殖并影响其干性表达等,且与患者的疾病预后相关。在本研究中,我们将结合本课题组在前期对于meis2所做的研究,进一步探讨meis2在CRC的表达,并通过构建过表达及敲除meis2结直肠癌细胞系检测其对CRC细胞的干性等恶性表型的影响,探索可能的分子机制,在结直肠癌的预防和靶向治疗上提供足够的理论基础。基于以上目的,我们将研究分为以下三个部分:第一部分 meis2在结直肠癌细胞和组织中的表达及意义目的:探索meis2在结直肠癌细胞和组织中的表达及意义。方法:检测在5株不同的结直肠癌细胞系中和正常结直肠癌上皮细胞NCM460的meis2 m RNA表达水平,并通过q RT-PCR实验得出相对高表达meis2和相对低表达meis2的结直肠癌细胞系各一株。抽取5对结直肠癌患者的癌组织及正常组织进行免疫组化分析;通过生物信息学分析TCGA等数据库在结直肠癌中的表达水平及其临床意义。结果:免疫组化结果提示meis2在正常结直肠癌患者主要表达在胞浆和胞核,在结直肠癌组织中低表达或不表达;通过q RT-PCR实验得出结直肠癌细胞系的表达量均低于正常结直肠上皮细胞;高表达meis2组的无病生存期高于低表达组,差异具有统计学意义。结论:meis2的表达水平在结直肠癌细胞和组织中低于正常结直肠细胞和组织,其表达与结直肠患者预后呈负相关。第二部分 meis2调控结直肠癌细胞的干性和奥沙利铂化疗耐药性目的:初步探索meis2在结直肠癌细胞调控形成干性和奥沙利铂化疗耐药性。方法:通过慢病毒转染构建过表达和敲除该基因稳定细胞系,采用Western Blot实验和q RT-PCR实验检测慢病毒载体的转染效率及表达水平;进行细胞成球实验检测不同细胞系的成球能力;通过Western blot实验探索其干性标志物的蛋白水平的相对表达;采用CCK-8和平板克隆法分别评估过表达细胞系和敲除细胞系的增殖能力,流式细胞术分析对细胞凋亡的影响;通过MTT实验检测处理不同浓度奥沙利铂处理后的细胞生存率;进行生物信息学分析。结果:成功构建稳定过表达meis2的细胞系SW620-meis2和DLD1-meis2和敲除meis2的细胞系SW620-sh RNA-meis2和DLD1-sh RNA-meis2,及其配对对照组细胞系SW620-NC和DLD1-NC,先用荧光显微镜观察24h后转染情况,再分别采用Western Blot实验和q RT-PCR实验检测慢病毒载体的转染效率,过表达细胞系的该基因的表达水平均显著上升,敲减细胞系的该基因表达均显著下降;meis2表达水平较高的SW620成球率明显较低,相比于meis2表达水平较低的DLD1细胞的成球率;meis2过表达的细胞系成球能力下降,并且相对应的CD133以及Lgr5的蛋白表达水平也降低,而在meis2敲除的细胞系中,其成球能力相对增加,相对应的CD133以及Lgr5的蛋白表达水平相对上升。使用CCK-8法和平板细胞克隆法分别评估敲除细胞系和过表达细胞系的细胞增殖情况,检测细胞活力,分别与配对照组细胞系SW620-NC和DLD1-NC相比,过表达细胞系SW620-meis2和DLD1-meis2中的细胞增殖活力明显下降,而敲除细胞系SW620-sh RNA

关键词：结直肠癌 meis2 奥沙利铂耐药干性凋亡

meis2参与TGF-β/Smad信号通路作用在非小细胞肺癌的初步研究

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Meis2参与TGF-β/Smad信号通路作用在非小细胞肺癌的初步研究

作者：王昭三峡大学

学位级别：硕士

目的:（1）探讨meis2、Smad4及Smad7蛋白在非小细胞肺癌（non small-cell l ung cancer,NSCLC）细胞中的表达情况;（2）初步探索meis2在NSCLC细胞中参与TGF-β/Smad信号通路的作用机制。方法:（1）收集2012年2月至2019年2月在宜昌市第... 详细信息

目的:（1）探讨meis2、Smad4及Smad7蛋白在非小细胞肺癌（non small-cell l ung cancer,NSCLC）细胞中的表达情况;（2）初步探索meis2在NSCLC细胞中参与TGF-β/Smad信号通路的作用机制。方法:（1）收集2012年2月至2019年2月在宜昌市第一人民医院住院手术切除并经病理确诊的石蜡包埋NSCLC及良性病变组织标本80例,除外合并其他部位恶性肿瘤及转移瘤。应用免疫组化方法检测病理组织中meis2、Smad4及Smad7的蛋白表达水平;（2）通过慢病毒转染的方法将PLKO.1-meis2-shRNA感染A549细胞,运用实时定量荧光聚合酶链锁反应（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）方法检测基因抑制效率;（3）RT-qPCR感染后A549细胞中TGF-β/Smad信号通路相关因子m RN A表达水平;（4）WB检测A549细胞中TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达水平。结果:（1）meis2蛋白在肺癌组织中阳性表达率较良性病变升高,Smad4蛋白在恶性肿瘤组织中表达较良性病变降低;Smad7蛋白在恶性肿瘤组织中表达较良性病变明显增高;且meis2与Smad7表达呈正相关性;（2）将质粒p LKO.1-meis2成功转染至293FT细胞,收集病毒液感染A549细胞,运用RT-qPCR检测meis2 mRNA水平降低,W estern-Blot方法检测meis2基因蛋白表达降低,提示转染成功;（3）RT-qPCR检测显示,实验组与对照组（meis2-shRNA-GFP组）相比,Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达受到抑制,而TGF-β1、TGF-β2、Smad4的mRNA表达增强;（4）Western-Blot方法检测显示,实验组与对照组相比,Smad4蛋白表达增强1.4～1.8倍,Smad2、Smad3、S mad7的蛋白表达降低。结论:（1）meis2基因参与了非小细胞肺癌的发生发展;（2）meis2基因参与了NSCLC细胞中TGF-β介导的Smad信号通路。

关键词： meis2 TGF-β/Smad信号通路肺肿瘤慢病毒转染免疫组化

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除meis2基因的HEK293T人胚肾细胞系

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中国细胞生物学学报 2015年第4期37卷 535-541页

作者：卢利莎白杨刘鑫王洪涛高洁杨亦青苏培刘翠翠王钰张磊升熊涛周家喜长江大学生命科学学院荆州434025 中国医学科学院北京协和医学院血液病医院(血液学研究所) 实验血液学国家重点实验室天津300020 河北北方学院医学检验学院张家口075000

CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进... 详细信息

CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、敲入等。meis2属于一类高度保守的同源盒转录因子meis家族,研究发现,meis2广泛参与胚胎的早期发育及肿瘤的发生发展,但其发挥作用的机制目前还不是很清楚。该研究针对meis2基因作用的功能域,设计两个靶向meis2基因Exon3和Exon8的sg RNA,通过SURVEYOR分析及Western blot检测,确认了所设计sg RNA的有效性。进一步通过细胞分选及Western blot检测筛选出稳定敲除meis2基因的HEK293T细胞株。最后,通过序列测定确认meis2发生了移码突变。综上所述,该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了完全敲除meis2的HEK293T细胞株,为研究meis2的功能和作用机制提供了有效工具。

关键词： meis2 CRISPR/Cas9系统基因敲除

HOXA10基因及其辅因子meis1，meis2在子宫内膜样腺癌中的表达及临床意义

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HOXA10基因及其辅因子MEIS1，MEIS2在子宫内膜样腺癌中的表达及临...

作者：黄博华中科技大学

学位级别：硕士

目的：检测子宫内膜样腺癌和各型增生内膜组织中HOXA10及其辅因子meis1，MESI2蛋白水平的表达，比较它们的表达差异，观察他们与子宫内膜样腺癌临床病理因素的关系，探讨HOXA10及其辅因子meis1，MESI2蛋白在子宫内膜样腺癌发生发展过程... 详细信息

目的：检测子宫内膜样腺癌和各型增生内膜组织中HOXA10及其辅因子meis1，MESI2蛋白水平的表达，比较它们的表达差异，观察他们与子宫内膜样腺癌临床病理因素的关系，探讨HOXA10及其辅因子meis1，MESI2蛋白在子宫内膜样腺癌发生发展过程中等生物学行为意义及临床病理学意义。方法：运用免疫组织化学方法检测15例正常子宫内膜组织、15例简单性增生、17例复杂性增生、19例不典型增生、52例子宫内膜样腺癌组织中HOXA10及其辅因子meis1，MESI2蛋白的表达。结果：***10在正常增生期、简单增生期、复杂增生期、非典型增生期及子宫内膜腺癌中表达呈下降趋势，在简单增生期与复杂增生期的表达分别与正常增生期相比，经方差检验有差异，具有统计学意义（P＜0.05）。非典型增生和子宫内膜腺癌中HOXA10蛋白表达比正常增生期表达明显下降，两者间有差异，具有统计学意义（P＜0.05）。 2. meis1在正常增生期、简单增生期、复杂增生期、非典型增生期及子宫内膜样腺癌中表达呈下降趋势，简单增生期和复杂增生期中meis1的表达与正常增生期相比有差异（P＜0.05），在非典型增生期和子宫内膜腺癌中，meis1的表达较正常增生期明显下降（P＜0.05）。 3. meis2在正常增生期、简单增生期、复杂增生期、非典型增生期及子宫内膜样腺癌中表达呈下降趋势，简单增生期和复杂增生期中meis2的表达与正常增生期相比有差异（P＜0.05），在非典型增生期和子宫内膜腺癌中，meis2的表达较正常增生期明显下降（P＜0.05）。 ***10及其辅因子meis1，meis2蛋白在不同内膜增生及内膜癌组织中的相关性。结论:HOXA10参与了子宫内膜癌的表达调控，并与其辅因子协同作用促进子宫内膜癌的侵蚀。

关键词：子宫内膜癌 HOXA10 辅因子 meis1 meis2

meis2、BRCA1表达的相关性及与术后非小细胞肺癌化疗预后的关系

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中华肺部疾病杂志（电子版） 2019年第4期12卷 430-435页

作者：黄长江聂婷婷王迎难倪吉祥三峡大学人民医院·宜昌市第一人民医院呼吸与危重症医学科宜昌443000 恩施州土家族苗族自治州中心医院ICU 恩施445000

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中meis2、BRCA1基因表达的相关性及与术后NSCLC化疗预后的关系。方法收集宜昌市第一人民医院2012年2月至2016年1月住院手术切除并经病理确诊NSCLC的石蜡包埋组织标本61例,收集整理标本对应患者的临床资料,... 详细信息

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中meis2、BRCA1基因表达的相关性及与术后NSCLC化疗预后的关系。方法收集宜昌市第一人民医院2012年2月至2016年1月住院手术切除并经病理确诊NSCLC的石蜡包埋组织标本61例,收集整理标本对应患者的临床资料,随访患者生存情况。应用免疫组化检测组织中meis2及BRCA1基因的表达,分析两者表达的相关性,并将meis2、BRCA1表达纳入生存分析,研究两者与NSCLC术后辅助化疗疗效之间的相关性。结果61例NSCLC患者中,meis2和BRCA1的高表达率分别为57.38%(35/61)和65.57%(40/61),两者表达呈正相关(r=0.59,P=0.003)。NSCLC患者接受基于铂类药物化疗4~6周期化疗后,20例CR+PR(32.8%),41例SD+PD(67.2%),meis2低表达患者有效率为21.3%(13/61),而meis2高表达有效率为11.5%(7/61),有极显著性差异(P23.0%(14/61),而BRCA1高表达有效率为9.8%(6/61),有极显著性差异(Pmeis2和BRCA1两者的表达存在显著正相关,meis2和BRCA1的表达与NSCLC术后接受铂类药物化疗的预后相关,meis2和BRCA1表达越低,化疗疗效越好。

关键词：非小细胞肺癌 meis2 BRCA1基因免疫组织化学技术

meis2基因沉默致A549细胞凋亡、细胞周期阻滞及调控机制研究

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国际呼吸杂志 2018年第12期38卷 886-892页

作者：黄长江赵天明张家祺聂婷婷王迎难倪吉祥三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院呼吸与危重症医学科 443000

目的观察meis2基因沉默后,肺腺癌A549细胞凋亡及细胞周期变化。通过基因芯片分析技术,探讨meis2在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中的调控机制。方法将构建成功的4组pLKO1-meis2-shRNA慢病毒载体重组质粒瞬时转染人胚肾细胞239FT,收集病毒... 详细信息

目的观察meis2基因沉默后,肺腺癌A549细胞凋亡及细胞周期变化。通过基因芯片分析技术,探讨meis2在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中的调控机制。方法将构建成功的4组pLKO1-meis2-shRNA慢病毒载体重组质粒瞬时转染人胚肾细胞239FT,收集病毒液感染A549细胞,显微镜下观察细胞形态,运用反转录-聚合酶链反应、免疫蛋白印迹检测meis2基因mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测A549细胞凋亡及细胞周期变化,基因芯片检测基因表达变化。结果有2组pLKO1-meis2-shRNA重组质粒能有效沉默meis2的表达,meis2mRNA、meis2蛋白表达降低,光镜下A549细胞皱缩、凋亡增加;流式细胞术提示细胞凋亡,细胞周期G2/M比例增高,基因芯片检测分析发现人乳腺癌易感基因1（BRCA1）表达下调明显。结论shRNA干扰技术介导A549细胞的meis2沉默,出现细胞凋亡,G2/M比例增高,BRCA1相关分子通路可能是meis2的重要下游靶通路,提示meis2可能通过BRCA1调控NSCLC细胞生长及细胞周期阻滞。

关键词：非小细胞肺癌 meis2 人乳腺癌易感基因1 基因沉默基因芯片分析

HOXB13 mutations and binding partners in prostate development and cancer:Function,clinical significance, and future directions

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Genes & Diseases 2017年第2期4卷 75-87页

作者： Hannah Brechka Raj R.Bhanvadia Calvin VanOpstall Donald J.Vander Griend The Committee on Cancer Biology The University of ChicagoChicagoILUSA The Pritzker School of Medicine The University of ChicagoChicagoILUSA Department of Surgery Section of UrologyThe University of ChicagoChicagoILUSA

The recent and exciting discovery of germline HOXB13 mutations in familial prostate cancer has brought HOX signaling to the forefront of prostate cancer *** enhanced understanding of HOX signaling,and the co-factors regulating HOX protein specificity and transcriptional regulation,has the high potential to elucidate novel approaches to prevent,diagnose,stage,and treat prostate *** our understanding of HOX biology in prostate development and prostate cancer,basic research in developmental model systems as well as other tumor sites provides a mechanistic framework to inform future studies in prostate *** we describe our current understanding of HOX signaling in genitourinary development and cancer,current clinical data of HOXB13 mutations in multiple cancers including prostate cancer,and the role of HOX protein co-factors in development and *** data highlight numerous gaps in our understanding of HOX function in the prostate,and present numerous potentially impactful mechanistic and clinical opportunities for future investigation.

关键词： Androgen receptor HOXB13 HOXB13(G84E) meis1 meis2 PBX Prostate TALE