检索结果-南通市图书馆

畜牧与兽医 2008年第4期40卷 73-76页

作者：邵红李春龙周玉龙李娜侯喜林朴范泽黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 九三分局山河农场畜牧科黑龙江黑河161421

本研究应用PCR方法鉴定出1例无浆体病牛,将扩增的DNA片段进行克隆测序鉴定并进行同源性分析。结果发现目的基因与边缘无浆体(Anaplsma marginale)LZ株和HN株msp5基因的同源性是100%,进而证实黑龙江分离株与兰州株边缘无浆体msp5基因序... 详细信息

本研究应用PCR方法鉴定出1例无浆体病牛,将扩增的DNA片段进行克隆测序鉴定并进行同源性分析。结果发现目的基因与边缘无浆体(Anaplsma marginale)LZ株和HN株msp5基因的同源性是100%,进而证实黑龙江分离株与兰州株边缘无浆体msp5基因序列高度同源。

关键词：无浆体病 PCR msp5基因序列分析奶牛

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边缘无浆体msp5基因的克隆、原核表达及ELISA方法的建立

边缘无浆体MSP5基因的克隆、原核表达及ELISA方法的建立

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作者：马米玲中国农业科学院

学位级别：硕士

边缘无浆体病是由蜱传播的、边缘无浆体寄生于牛红细胞内所引起的立克氏体病。该病几乎遍布我国各省(区)，严重威胁着养牛业的发展。本试验根据已发表的msp5基因序列，设计引物，利用PCR技术自感染边缘无浆体基因组DNA中扩增msp5基因，... 详细信息

边缘无浆体病是由蜱传播的、边缘无浆体寄生于牛红细胞内所引起的立克氏体病。该病几乎遍布我国各省(区)，严重威胁着养牛业的发展。本试验根据已发表的msp5基因序列，设计引物，利用PCR技术自感染边缘无浆体基因组DNA中扩增msp5基因，通过将产物与pGEM-T Easy载体连接，构建重组克隆载体pGEM-TEasy-msp5。基因测序结果表明，本试验所获得的msp5基因核苷酸序列和所编码氨基酸的序列与GenBank中收录的边缘无浆体国外株的同源性分别为98.6％和99％。根据开放阅读框(ORF)两侧序列重新设计并合成表达引物，以重组质粒pGEM-T Easy-msp5为模板，进行PCR扩增，将扩增产物与pGEX-4T-1质粒连接，构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-msp5，将其转化到DH5α宿主菌中，用IPTG进行诱导表达，所表达的目的蛋白部分为分泌性表达，大部分呈包涵体。SDS-PAGE和Western-blot分析表明，msp5基因在大肠杆菌中成功获得了表达，目的蛋白约占菌体总蛋白的35.0％，并与GST形成融合形式，分子量大小为45Ku左右，与预期的大小相吻合，且可被兔抗牛边缘无浆体阳性血清所识别。通过裂解、洗涤、变性、复性等方法对包涵体蛋白进行处理，以所获得的纯化产物作为抗原，构建了ELISA诊断方法：实验证实，该方法的阳性符合率和阴性符合率分别为100％(100／100)和98％(98／100);对实验感染牛的抗体消长规律进行了观察，结果显示，动物感染后第5天即可查出抗体(滴度为1：50)，第90天时抗体达到高峰(滴度为1：3200)，然后逐渐下降，感染后第5个月抗体效价为1：1600;对自新疆、内蒙古、黑龙江、吉林、四川和甘肃六省区的血清样品进行了检测，阳性率分别为67.63％(700／1035)、81.78％(184／225)、82.78％(149／180)、46.11％(139／180)、66.67％(83／180)和77.22％(90／135)，结果与过去采用病原学检测获得的结果基本一致。上述结果表明，所建立的方法可用于边缘无浆体病的血清学调查。

关键词：边缘无浆体 msp5基因克隆原核表达 ELISA 抗体消长血清学调查

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边缘无浆体msp5基因序列分析及其融合蛋白的纯化

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动物医学进展 2008年第8期29卷 13-16页

作者：马米玲殷宏李有全高金亮关贵全刘志杰刘爱红刘军龙任巧云罗建勋中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

参照已发表的主要表面蛋白5(msp5)基因的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模版,采用PCR技术扩增获得了msp5基因;将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析,结果表明,克隆的msp5基因与GenBank上登录的Florida株... 详细信息

参照已发表的主要表面蛋白5(msp5)基因的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模版,采用PCR技术扩增获得了msp5基因;将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析,结果表明,克隆的msp5基因与GenBank上登录的Florida株msp5基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。通过裂解、洗涤、变性、复性等方法对包涵体蛋白进行处理,获得的纯化产物浓度为1 mg/mL。

关键词：边缘无浆体 msp5基因序列分析

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边缘无浆体msp5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2008年第8期38卷 641-645页

作者：马米玲殷宏关贵全李有全高金亮刘志杰刘爱红刘军龙任巧云罗建勋中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室

将边缘无浆体msp5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白。Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体msp5的间接ELISA检测方法。该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100... 详细信息

将边缘无浆体msp5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白。Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体msp5的间接ELISA检测方法。该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应。结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性。

关键词：边缘无浆体 msp5基因间接ELISA

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边缘无浆体msp5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者：马米玲罗建勋殷宏关贵全李有全高金亮刘志杰刘爱红刘军龙任巧云中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

边缘无浆体病是由蜱或其他吸血昆虫传播的立克次体病,给养牛业带来了极大的危害。本病主要分布在热带和亚热带地区,在温带地区也有报道。在我国广东、贵州、湖南、四川、河南、新疆等省区均有本病流行的报道。急性边缘无浆体病可导致动... 详细信息

边缘无浆体病是由蜱或其他吸血昆虫传播的立克次体病,给养牛业带来了极大的危害。本病主要分布在热带和亚热带地区,在温带地区也有报道。在我国广东、贵州、湖南、四川、河南、新疆等省区均有本病流行的报道。急性边缘无浆体病可导致动物贫血、流产、产乳量下降,甚至死亡,耐过动物终生带菌,立克次体的血球感染率在0.1%左右,由于血球感染率太低,用血涂片染色观察方法检测常常发生漏检。尽管PCR技术和分子杂交技术已广泛应用于隐性感染动物的检测,但它们均不适于大规模流行病学调查。在血清学测试方法中,卡片凝集试验和补体结合试验已被用于本病的检测,这些方法也被列入国际贸易中本病的口岸检疫的标准方法。此外,免疫荧光技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)得到了一定规模的应用。但是,当前诊断本病大多数使用的抗原都是粗提的虫体抗原,其敏感性和特异性较低,所以人们逐渐将目光集中在重组抗原上。msp5是分子质量为19ku的膜蛋白,在边缘无浆体、羊无浆体和中央无浆体之间相当保守,适合作为诊断抗原。笔者在边缘无浆体msp5蛋白基因克隆、表达的基础上口,建立了一种重组抗原的间接ELISA诊断方法。首先将边缘无浆体msp5基因在大肠杆菌DH5a中表达,获得45 ku的融合蛋白。Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体msp5的间接ELISA检测方法。该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应。结果表明,建立的间接EI ISA方法具有良好的特异性和敏感性。

关键词：边缘无浆体 msp5基因间接ELISA

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