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骨髓间充质干细胞对肝癌细胞mhcc97-H和mhcc97-l侵袭能力和增殖能力的影响

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临床和实验医学杂志 2016年第2期15卷 110-112页

作者：文政伟余洁梅晏洁影陈创杰深圳市宝安区松岗人民医院消化内科广东深圳518000 南方医科大学附属新会人民医院消化内科广东江门518105

目的研究骨髓间充质干细胞对肝癌细胞mhcc97-H和mhcc97-l侵袭能力和增殖能力的影响。方法培养肝癌细胞mhcc97-H和mhcc97-l株,分为两组,对照组用不含FBS的DMEM培养基处理,处理组用骨髓间充质干细胞处理,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色... 详细信息

目的研究骨髓间充质干细胞对肝癌细胞mhcc97-H和mhcc97-l侵袭能力和增殖能力的影响。方法培养肝癌细胞mhcc97-H和mhcc97-l株,分为两组,对照组用不含FBS的DMEM培养基处理,处理组用骨髓间充质干细胞处理,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞增殖能力,采用划痕试验检测细胞侵袭能力,采用实时荧光PCR检测血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)的mRNA含量。结果 1增殖能力:处理组mhcc97-H、mhcc97-l细胞MTt值明显高于对照组(219.5±23.4 vs.100±15.2,224.4±32.2 vs.100±16.8);2侵袭能力:处理组mhcc97-H、mhcc97-l细胞(A0-A24)/A0明显低于对照组(33.48±4.95 vs.100±16.82,27.62±3.45 vs.100±16.20);3VEGF、MMP的mRNA含量:处理组VEGF的mRNA含量明显高于对照组(232.5±24.5 vs.100±14.5,234.8±31.9 vs.100±15.5)pg/ml,MMP2、MMP9的mRNA含量明显低于对照(29.1±3.3 vs.100±15.8,32.7±3.8 vs.100±16.8;34.4±4.1 vs.100±16.4,28.4±4.1 vs.100±16.0)ng/ml。结论骨髓间充质干细胞能够增强肝癌细胞mhcc97-H和mhcc97-l的增殖能力、上调VEGF的表达,但是却能降低细胞的侵袭能力、下调MMP2和MMP9的表达。

关键词：肝癌骨髓间充质干细胞 mhcc97-H mhcc97-l 侵袭增殖

奥曲肽对人肝癌细胞株BEl-7402和mhcc97-l中血管内皮生长因子表达与合成的影响

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中华实验外科杂志 2004年第2期21卷 231-231页

作者：傅斌生许戈良翟志敏余继海徐修才任学雷安徽省立医院普外科合肥230001 安徽省立医院中心实验室合肥230001

本研究旨在探讨奥曲肽是否对人肝癌细胞中的血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响阐明其抗肿瘤血管生成的作用机制。

关键词：奥曲肽肝癌细胞株 BEl-7402 mhcc97-l 血管内皮生长因子表达合成

DlC-1基因表达与肝细胞癌复发转移的关系

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中华肝脏病杂志 2005年第6期13卷 428-431页

作者：宋丽杰叶胜龙王凯峰翁永强梁春敏孙瑞霞赵燕刘银坤汤钊猷复旦大学肝癌研究所中山医院教育部癌变与侵袭原理重点实验室上海200032

目的已报道人类染色体8p缺失可能与肝癌转移有关,本文应用实时定量聚合酶链反应(RQ- PCR)研究位于8p的DlC-1基因mRNA表达与肝细胞癌侵袭转移的关系。方法收集51例复旦大学中山医院外科手术切除的肝细胞癌(HCC)及癌旁正常组织标本,根据... 详细信息

目的已报道人类染色体8p缺失可能与肝癌转移有关,本文应用实时定量聚合酶链反应(RQ- PCR)研究位于8p的DlC-1基因mRNA表达与肝细胞癌侵袭转移的关系。方法收集51例复旦大学中山医院外科手术切除的肝细胞癌(HCC)及癌旁正常组织标本,根据临床病理学指标,分为高低侵袭性两组,用RQ-PCR对不同侵袭性HCC之间的DlC-1基因表达进行分析。对不同侵袭转移潜能mhcc97-l、mhcc97-H、HCClM3、Hep3B及HepG2肝癌细胞系用同样方法分析DlC-1基因的表达差异。结果非转移细胞系Hep3B和HepG2与转移细胞系mhcc97-l、mhcc97-H和HCClM3之间DlC—1基因表达差异有统计学意义(PlC-1表达水平也相应逐步降低;HCClM3 细胞系显著低于mhcc97-l细胞系(PlC-1基因表达明显低于低侵袭性HCC组(PlC-1基因表达与肝癌的侵袭转移的抑制相关,其表达可能在抑制肝癌的侵袭转移中发挥重要作用。

关键词：肝细胞癌复发转移 mhcc97-l mhcc97-H 实时定量聚合酶链反应 HCClM3 基因mRNA表达 HepG2 Hep3B 侵袭转移外科手术切除 RQ-PCR 基因表达差异低侵袭性转移潜能染色体8p 病理学指标肝癌细胞系肝癌转移组织标本中山医院

流体力学方法转染IκBαSR对人肝癌裸鼠原位移植瘤的抑制

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南京医科大学学报（自然科学版） 2010年第6期30卷 736-740,892页

作者：赵亮刘巧玉殷爱红姜润秋时建王学浩孙倍成南京医科大学第一附属医院肝脏移植中心江苏南京210029

目的:使用流体力学方法向人肝癌裸鼠原位移植瘤转染含突变型IκBα的重组逆转录病毒质粒pBABE-puro-IκBα super repressor(pBABE-puro-IκBαSR),观察其对移植瘤生长的作用及其相关机制。方法:使用人肝癌细胞株mhcc97-H、mhcc97-l,建... 详细信息

目的:使用流体力学方法向人肝癌裸鼠原位移植瘤转染含突变型IκBα的重组逆转录病毒质粒pBABE-puro-IκBα super repressor(pBABE-puro-IκBαSR),观察其对移植瘤生长的作用及其相关机制。方法:使用人肝癌细胞株mhcc97-H、mhcc97-l,建立裸鼠人肝癌原位移植瘤模型,将荷瘤鼠分为mhcc97-H组(对照组)、mhcc97-H+IκBαSR组(转染组)、mhcc97-l组(对照组)和mhcc97-l+IκBαSR组(转染组),1周后,使用流体力学方法通过尾静脉向对照组注射pBABE-puro空载体质粒,向转染组注射pBABE-puro-IκBαSR质粒。每周1次,共3次。观察荷瘤鼠的生存率,检测原位移植瘤块的大小、重量、以及转移瘤数目,使用全自动生化检测仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶(AlT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。采用免疫组化SP法分析核因子(NF)-κBp65蛋白表达,使用Westernblot检测总蛋白中IκBα蛋白含量。结果:pBABE-puro-IκBαSR质粒显著提高荷瘤小鼠的生存率,转染组肿瘤的体积、重量显著小于对照组,抑瘤率分别为29.3%和33.0%(均PlT和AST显著低于对照组(均Plot结果显示,转染组IκBα表达水平高于对照组(P<0.05)。结论:通过流体力学方法向人肝癌原位移植瘤转染突变型IκBαSR质粒,可以抑制移植瘤的生长。其机制可能是IκBαSR抑制了NF-κB的活化。

关键词： IκBαSR mhcc97-H mhcc97-l 肝肿瘤原位移植模型流体力学转染

转录因子DEC1在调节肝癌血管生成的作用及其机制研究

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转录因子DEC1在调节肝癌血管生成的作用及其机制研究

作者：刘杰南京医科大学

学位级别：硕士

肝细胞癌是一种严重威胁人类生命健康的重要疾病,也是在世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的高转移率以及术后高复发率使得传统的治疗和预后效果越来越局限。血管生成是影响肿瘤转移的重要因素之一。新生血管为肿瘤组织不断的输送... 详细信息

肝细胞癌是一种严重威胁人类生命健康的重要疾病,也是在世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的高转移率以及术后高复发率使得传统的治疗和预后效果越来越局限。血管生成是影响肿瘤转移的重要因素之一。新生血管为肿瘤组织不断的输送营养物质以及排泄代谢产物,同时也为肿瘤的侵袭和转移提供良好的通道。研究报道显示多种信号分子参与血管生成,其中VEGFA以及MMP9是最重要的促血管生成因子。DEC1是一个胚胎软骨发育基因,也是碱性螺旋-环-螺旋结构类转录调节因子,在对软骨形成、脂质代谢、细胞分化衰老、肿瘤的发生中起着重要的作用。近年来研究发现DEC1在多种肿瘤中呈现组织特异性的表达模式,而且发现它还是一个与肿瘤的发生发展有关的转录因子,在肿瘤细胞的增殖、分化中起着重要的作用。血管生成是肿瘤复发和转移的重要因素,并且可能是目前和未来肿瘤治疗的重要靶点,因此探讨DEC1对肿瘤血管生成的作用有着重要的现实意义,目前尚未有研究报道。第一部分过表达/敲除DEC 1对内皮细胞增殖、迁移及血管形成的影响目的：探讨过表达/敲除DEC1对内皮细胞增殖、迁移及血管形成的影响方法： (1)过表达DEC1细胞系的建立：采用脂质体瞬时转染入内皮细胞得到空质粒组Flag-CMV2,过表达DEC1组Flag-DEC1;敲除DEC1细胞系的建立：将包装好的慢病毒感染内皮细胞系,通过嘌呤霉素抗性筛选得到表达shDEC1的稳转细胞株用于后续实验,得到空病毒组shRNA,敲除DEC1组shDEC1。(2)采用MTT法检测比较DEC1基因对内皮细胞增殖能力的影响。 (3)运用Transwell小室实验、划痕实验比较DEC1的表达对内皮细胞迁移能力的影响。 (4)使用小管形成实验检测DEC1的表达对内皮细胞成管能力的影响(5)通过Real-time PCR和Western blot检测基因在mRNA和蛋白水平上的表达。结果： (1)瞬时转染DEC1的内皮细胞与空质粒的对照组相比,DEC1的表达显著增高;慢病毒感染内皮细胞经过嘌呤霉素筛选30天后,空病毒对照组与稳定表达shDEC1的细胞生长状态均良好,且蛋白水平检测敲除效率明显。(2)DEC1过表达/敲除对内皮细胞HUVEC增殖、迁移以及成管能力的影响：a,增殖能力：相对于空质粒对照组Flag-CMV2,过表达组Flag-DEC1的内皮细胞生长速度下降;与空病毒组shRNA相比,敲除组shDEC1的内皮细胞生长速度加快,细胞OD值增加明显;b,迁移能力：和对照组Flag-CMV2相比,Flag-DEC1组的细胞在划痕实验中,细胞向中心迁移的距离变小,在小室穿膜实验中,醋酸洗脱的细胞OD值降低,穿膜数目减少;而相对于shRNA, shDEC1组细胞向划痕中心迁移距离增大,几乎覆盖整个中心区域,细胞OD值升高,穿膜细胞数增加。c,成管能力：与对照组Flag-CMV2相比,Flag-DEC1组的内皮细胞小管长度缩短了48.28%,相对于shRNA, shDEC1细胞小管长度增加了84.19%(3)过表达DEC1的内皮细胞其mRNA结果显示促血管生成因子VEGFA, bFGF, MMP9均显著降低,蛋白水平上VEGFA, MMP9的表达也明显减少;敲除DEC1的内皮细胞,mRNA结果显示促血管生成因子VEGFA, Angiogenin, MMP9均显著升高,蛋白水平上VEGFA, MMP9的表达也明显增加。(4)DEC1过表达对内皮细胞EAhy926增殖、迁移以及成管能力的影响：相对于空质粒对照组,过表达组Flag-DEC1的内皮细胞生长速度下降,细胞增殖能力降低;划痕实验中,细胞向中心迁移的距离变小,在小室穿膜实验中,醋酸洗脱液细胞OD值降低,穿膜数目减少,内皮细胞迁移能力降低;与对照组相比,Flag-DEC1组的内皮细胞小管长度缩短了57.22%,成管能力降低,Real-time PCR结果显示促血管生成因子VEGFA, bFGF, MMP9均显著降低,蛋白水平上VEGFA, MMP9的表达也明显减少。结论： (1)过表达DEC1基因能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及血管形成;敲除DEC1基因能促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及血管形成,初步探究DEC1可能是通过影响血管生成因子的表达,调节内皮细胞血管生成。 (2)过表达DEC1抑制内皮细胞EAhy926增殖、迁移以及血管生成,且可能与血管生长因子VEGFA、MMP9表达降低有关第二部分肝肿瘤细胞DEC 1影响内皮细胞体外血管形成目的：探讨肝肿瘤细胞DEC1对内皮细胞体外血管形成的影响方法： (1)使用敲除和过表达DEC1的肝癌细胞株,收集细胞培养上清液处理HUVEC内皮细胞(2)运用Transwell小室实验比较HUVEC内皮细胞迁移能力。(3)使用小管形成实验检测HUVEC内皮细胞成管能

关键词：内皮细胞 DEC1 迁移增殖血管生成 mhcc97-l mhcc97-H

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肝癌细胞血管生成拟态体外研究

肝癌细胞血管生成拟态体外研究

作者：孟立祥安徽医科大学

学位级别：硕士

目的: 研究肝癌细胞能否在体外生成血管生成拟态,探讨肝癌细胞体外血管生成拟态的可能机制,研究血管生成抑制剂TNP-470对肝癌细胞体外血管生成拟态的作用。方法: (1)建立肝癌细胞三维培养模型:建立HepG2肝癌细胞三维培养模型,观察其形... 详细信息

目的: 研究肝癌细胞能否在体外生成血管生成拟态,探讨肝癌细胞体外血管生成拟态的可能机制,研究血管生成抑制剂TNP-470对肝癌细胞体外血管生成拟态的作用。方法: (1)建立肝癌细胞三维培养模型:建立HepG2肝癌细胞三维培养模型,观察其形态特点,进行PAS染色、HE染色、电镜观察;建立遗传背景相似、不同转移潜能人肝癌细胞株(mhcc97-H和mhcc97-l)三维培养模型,比较形态差异、形成血管生成拟态特点、结构差异。 (2)探讨肝癌血管生成拟态的可能机制:在缺氧诱导条件下进行肝癌细胞的体外三维培养,用RT-PCR检测肝癌细胞缺氧状态下体外形成血管拟态过程HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA表达。 (3)研究血管生成抑制剂TNP-470对肝癌体外血管生成拟态的作用:应用MTT试验、体外侵袭实验,检测血管生成抑制剂TNP-470作用后mhcc97-H细胞增殖活性和侵袭力的变化。建立mhcc97-H细胞体外三维细胞培养模型,观察TNP-470对其形成血管生成拟态影响,应用扫描电镜、透射电镜观察细胞结构改变。结果: (1) HepG2细胞接种后72h后,可见肝癌细胞彼此之间相互连接,形成环状和网络样结构;经PAS染色观察,可见明显的环状PAS阳性图案,肝癌细胞变形,彼此相互连接,形成腔样、管状结构;经HE染色观察,可见肝癌细胞镶嵌样生长,彼此相互连接,形成网络样结构。扫描电镜下可见肝癌细胞簇集呈网络状,肝癌细胞伸出细长突起,彼此相互连接,呈镶嵌样生长,形成管状结构。而HepG2细胞缺氧24h后即彼此之间相互连接,形成环状、网络样结构。不同时间(16h、24h、32h )mhcc97-H形成管状、环状结构数量均多于mhcc97-l(Pmhcc97-H较低转移潜能的mhcc97-l,形成管状、网状结构的时间短、数量多。扫描电镜可见mhcc97-H细胞簇集呈网络状,肝癌细胞伸出细长突起,彼此相互紧密连接,镶嵌样生长,mhcc97-l细胞连接减少,结构松散,无明显管腔结构。透射电镜可见对照组mhcc97-H细胞表面大量微绒毛, mhcc97-l细胞表面微绒毛少,不明显。 (2)各组均表达HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA,肝癌细胞缺氧4h ,HIF-1αmRNA表达量开始增高,缺氧8小时表达量最高为1.043±0.019,显著高于常氧对照组0.220±0.005(Pl)作用mhcc97-H细胞,在490nm处测定每孔光吸收值(A值)分别为0.861±0.013、0.860±0.014、0.858±0.012、0.853±0.015,对照组为0.863±0.011,差异无统计学意义(P>0.05),提示TNP-470对mhcc97-H增殖无明显抑制作用。体外侵袭实验示TNP-470组侵袭细胞数随着TNP-470浓度上升减少,TNP-470对肝癌细胞的抑制率(inhibitory rate, IR)呈剂量依赖型,其中TNP-470 80、100μg/ml组侵袭细胞数为38.2±6.30、25.6±4.33个,低于对照组114.8±4.38个(Pmhcc97-H细胞侵袭,抑制率分别为66.7%和77.8%。管道形成试验示对照组、TNP-470组mhcc97-H细胞在基质胶三维培养时均可以形成管道状结构,对照组mhcc97-H细胞接种后48h,细胞均贴附在基质胶上,可见肝癌细胞彼此之间相互连接,形成网络样结构,结构完整,排列整齐。TNP-470组相比对照组,细胞呈单个环状、管状结构,环状、管状结构数量随TNP-470浓度上升而减少。其中TNP-470 100μg/ml组管状、环状结构数量48.6±9.61个,显著低于对照组142.2±10.21个(Pmhcc97-H较低转移潜能的mhcc97-l形成血管样结构时间短、数量多。 (2)缺氧可能是肝癌细胞血管生成拟态形成的重要诱因,与肝癌细胞表达HIF-1αmRNA和MMP

关键词：肝细胞癌血管生成拟态 HepG2 mhcc97-H mhcc97-l 三维培养 TNP-470 HIF-1αmRNA MMP-2mRNA