肝癌细胞血管生成拟态体外研究

作     者：孟立祥 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李建生

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝细胞癌 血管生成拟态 HepG2 MHCC97-H MHCC97-L 三维培养 TNP-470 HIF-1αmRNA MMP-2mRNA 

摘      要：目的: 研究肝癌细胞能否在体外生成血管生成拟态,探讨肝癌细胞体外血管生成拟态的可能机制,研究血管生成抑制剂TNP-470对肝癌细胞体外血管生成拟态的作用。 方法: (1)建立肝癌细胞三维培养模型:建立HepG2肝癌细胞三维培养模型,观察其形态特点,进行PAS染色、HE染色、电镜观察;建立遗传背景相似、不同转移潜能人肝癌细胞株(MHCC97-H和MHCC97-L)三维培养模型,比较形态差异、形成血管生成拟态特点、结构差异。 (2)探讨肝癌血管生成拟态的可能机制:在缺氧诱导条件下进行肝癌细胞的体外三维培养,用RT-PCR检测肝癌细胞缺氧状态下体外形成血管拟态过程HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA表达。 (3)研究血管生成抑制剂TNP-470对肝癌体外血管生成拟态的作用:应用MTT试验、体外侵袭实验,检测血管生成抑制剂TNP-470作用后MHCC97-H细胞增殖活性和侵袭力的变化。建立MHCC97-H细胞体外三维细胞培养模型,观察TNP-470对其形成血管生成拟态影响,应用扫描电镜、透射电镜观察细胞结构改变。 结果: (1) HepG2细胞接种后72h后,可见肝癌细胞彼此之间相互连接,形成环状和网络样结构;经PAS染色观察,可见明显的环状PAS阳性图案,肝癌细胞变形,彼此相互连接,形成腔样、管状结构;经HE染色观察,可见肝癌细胞镶嵌样生长,彼此相互连接,形成网络样结构。扫描电镜下可见肝癌细胞簇集呈网络状,肝癌细胞伸出细长突起,彼此相互连接,呈镶嵌样生长,形成管状结构。而HepG2细胞缺氧24h后即彼此之间相互连接,形成环状、网络样结构。不同时间(16h、24h、32h )MHCC97-H形成管状、环状结构数量均多于MHCC97-L(P0.05),提示TNP-470对MHCC97-H增殖无明显抑制作用。体外侵袭实验示TNP-470组侵袭细胞数随着TNP-470浓度上升减少,TNP-470对肝癌细胞的抑制率(inhibitory rate, IR)呈剂量依赖型,其中TNP-470 80、100μg/ml组侵袭细胞数为38.2±6.30、25.6±4.33个,低于对照组114.8±4.38个(P0.01),能明显抑制MHCC97-H细胞侵袭,抑制率分别为66.7%和77.8%。管道形成试验示对照组、TNP-470组MHCC97-H细胞在基质胶三维培养时均可以形成管道状结构,对照组MHCC97-H细胞接种后48h,细胞均贴附在基质胶上,可见肝癌细胞彼此之间相互连接,形成网络样结构,结构完整,排列整齐。TNP-470组相比对照组,细胞呈单个环状、管状结构,环状、管状结构数量随TNP-470浓度上升而减少。其中TNP-470 100μg/ml组管状、环状结构数量48.6±9.61个,显著低于对照组142.2±10.21个(P0.01),抑制率为65.8%。扫描电镜可见对照组肝癌细胞簇集呈网络状,肝癌细胞伸出细长突起,彼此相互紧密连接,镶嵌样生长。TNP-470组细胞连接减少,结构松散,无明显管腔结构。透射电镜可见对照组肝癌细胞表面大量微绒毛,TNP-470组细胞表面微绒毛减少。 结论: (1)肝癌细胞可自身变形在体外形成血管生成拟态。高转移潜能的MHCC97-H较低转移潜能的MHCC97-L形成血管样结构时间短、数量多。 (2)缺氧可能是肝癌细胞血管生成拟态形成的重要诱因,与肝癌细胞表达HIF-1αmRNA和MMP