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Taqman mgb探针快速定量检测VHSV方法的研究

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高技术通讯 2010年第2期20卷 208-213页

作者：许建明张念之蒋一男张利峰夏春中国农业大学动物医学院农业部预防兽医学重点实验室北京100094 北京出入境检验检疫局北京101113

为建立准确实时地定量检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV),在VHSV-N基因保守区设计了Taqman mgb探针与引物对,随后,采用体外转录技术获得了VHSV-N基因RNA,并以此为绝对定量标准品,建立了绝对定量(AQ)检测VHSV的实时荧光RT-PCR法(AQ-RT-PC... 详细信息

为建立准确实时地定量检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV),在VHSV-N基因保守区设计了Taqman mgb探针与引物对,随后,采用体外转录技术获得了VHSV-N基因RNA,并以此为绝对定量标准品,建立了绝对定量(AQ)检测VHSV的实时荧光RT-PCR法(AQ-RT-PCR方法),并与世界动物卫生组织(OIE)推荐的普通RT-PCR法进行了比较。此荧光RT-PCR法特异性好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。检测线性范围为10^(10)～10~2拷贝/反应,灵法度达10~2拷贝/反应。此检测灵敏度比OIE推举的RT-PCR法高出5个数量级,比嵌套RT-PCR高出1个数量级。此法是出入境检疫VHSV的有效方法。

关键词：病毒性出血性败血症病毒(VHSV) Taqman mgb探针荧光RT—PCR法定量检测

mgb探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌

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安徽农业科学 2009年第19期37卷 8911-8913页

作者：高建忠魏雪童琰黄玉邦上海海洋大学水产与生命学院上海201306 宁夏盐池县畜牧局宁夏盐池751500

以嗜水气单胞菌气溶素(aerolysin)基因为待检靶基因,设计一对引物和一条mgb(M inor Groove B inder)探针,Aero基因探针5′端用FAM基团标记,3′端用TaqMan-mgb标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1... 详细信息

以嗜水气单胞菌气溶素(aerolysin)基因为待检靶基因,设计一对引物和一条mgb(M inor Groove B inder)探针,Aero基因探针5′端用FAM基团标记,3′端用TaqMan-mgb标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1.25×100CFU/μl;试验中嗜水气单胞菌检测结果均为阳性,而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性;重复性试验中,批间差异小于5%,批内差异小于3%。试验结果显示,荧光定量PCR方法可对致病性嗜水气单胞菌株进行快速鉴定。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。

关键词：嗜水气单胞菌荧光定量PCR mgb探针气溶素基因检测

TaqMan—mgb探针实时荧光聚合酶链反应快速检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变

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中华肿瘤杂志 2007年第2期29卷 119-123页

作者：周彩存周崧雯潘虹粟波高志强同济大学附属上海市肺科医院肿瘤科上海200433

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）瘤组织表皮生长因子受体（EGFR）基因突变及TaqMan mgb探针实时荧光PCR快速检测EGFR突变的诊断价值。方法应用聚合酶链（PCR）反应，对80例手术切除NSCLC瘤组织EGFR基因的第18、19和21外显子片段进行扩增... 详细信息

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）瘤组织表皮生长因子受体（EGFR）基因突变及TaqMan mgb探针实时荧光PCR快速检测EGFR突变的诊断价值。方法应用聚合酶链（PCR）反应，对80例手术切除NSCLC瘤组织EGFR基因的第18、19和21外显子片段进行扩增和测序，Chromas软件分析基因突变。设计EGFR突变位点的TaqMan mgb探针，采用实时PCR检测瘤组织EGFR突变，并与测序结果比较。实时PCR的敏感性与特异性评价，用不同混合数量的PC-9细胞（19外显子缺失）为阳性参照。结果21例NSCLC瘤组织存在EGFR基因突变，总体突变率为26．3％。其中13例为EGFR第19外显子阅读框内多核苷酸的缺失，8例为第21外显子2573位核苷酸点突变。诊断的特异性与敏感性均为100％。当PC-9突变型细胞仅占10％时或PC-9细胞数低达50只时，PCR仍然检测到EGFR基因突变的存在。女性、不吸烟和肺腺癌患者EGFR基因突变率显著高于男性、吸烟和非腺癌患者（P＜0．05）。EGFR基因突变与患者年龄、TNM分期等因素无关。结论NSCLC存在EGFR基因的突变或缺失，其中以女性、腺癌和不吸烟患者突变率较高。TaqMan mgb探针联合实时PCR可有效地检测出EGFR基因突变，操作简便，易于临床推广。

关键词：非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因 TaqMan mgb探针聚合酶链反应外显子

mgb探针检测广州地区汉族人群糖尿病亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C→T多态性

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中国糖尿病杂志 2006年第4期14卷 258-260页

作者：史成军何蕴韶程钢王伟毅刘娟徐杰符立梧中山大学达安基因诊断中心广州510080

186例T2DM,46例T1DM和110例正常对照的研究显示,糖尿病微血管病变与MTHFR基因677C→T多态性的显著相关性,仅见于T2DM,不见于T1DM。TaqMan-mgb探针技术是检测677C→T多态性的良好平台。

关键词：糖尿病亚甲基四氢叶酸还原酶基因 mgb探针

应用TaqMan mgb探针检测小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌

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植物病理学报 2006年第2期36卷 142-151页

作者：章桂明程颖慧王颖杨伟东易建平深圳出入境检验检疫局深圳518010 上海出入境检验检疫局上海200331

以小麦印度腥黑穗病菌9个菌株和黑麦草腥黑穗病菌5个菌株及其近似种或相关种:稻粒黑粉菌、狼尾草腥黑粉菌、狗尾草腥黑粉菌、苏玛特腥黑粉菌、狐尾草腥黑粉菌、小麦网腥黑穗病菌和小麦矮化腥黑穗病菌共9种22个菌株为研究对象,通过序列... 详细信息

以小麦印度腥黑穗病菌9个菌株和黑麦草腥黑穗病菌5个菌株及其近似种或相关种:稻粒黑粉菌、狼尾草腥黑粉菌、狗尾草腥黑粉菌、苏玛特腥黑粉菌、狐尾草腥黑粉菌、小麦网腥黑穗病菌和小麦矮化腥黑穗病菌共9种22个菌株为研究对象,通过序列比对分析,设计了检测小麦印度腥黑穗病菌及黑麦草腥黑穗病菌的TaqM an mgb实时荧光PCR引物和探针,优化了反应条件,筛选出特异性探针,分别建立了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌实时荧光单重PCR和实时荧光双重PCR检测方法,其中实时荧光双重PCR检测方法实现了在同一PCR管中仅用5μL的反应体系,进行1次PCR反应就能特异性检测出小麦印度腥黑穗病菌或黑麦草腥黑穗病菌。本研究所建立的检测方法特异性强、结果可靠、检测速度快、成本明显降低,在实际应用中具有推广价值。

关键词：小麦印度腥黑穗病菌黑麦草腥黑穗病菌 TaqMan mgb探针荧光单重PcR 荧光双重PCR

应用TaqMan mgb探针实时荧光定量PCR结合分离培养监测分析灰仓鼠细菌多样性

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药物分析杂志 2014年第2期34卷 221-227页

作者：高正琴邢进冯育芳关伟鸿贺争鸣岳秉飞中国食品药品检定研究院北京100050

目的:监测分析中国灰仓鼠细菌的多样性,收集更多的质量信息,获得更全面的微生物背景知识,为灰仓鼠的种群建立、生物净化和动物模型的建立提供科学的数据依据。方法:60只成年灰仓鼠来自新疆地区,安乐死后剖解采集标本。应用TaqMan mgb探... 详细信息

目的:监测分析中国灰仓鼠细菌的多样性,收集更多的质量信息,获得更全面的微生物背景知识,为灰仓鼠的种群建立、生物净化和动物模型的建立提供科学的数据依据。方法:60只成年灰仓鼠来自新疆地区,安乐死后剖解采集标本。应用TaqMan mgb探针实时荧光定量PCR和常规微生物学方法进行细菌多样性研究。结果:本研究采用常规微生物学方法从灰仓鼠中鉴定出179株细菌,包括大肠埃希菌、鲍氏志贺菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、栖冷克吕沃尔菌、嗜肺巴斯德菌、溶血性巴斯德菌、产气巴斯德菌、铜绿假单胞菌、栖稻假单胞菌、门多萨假单胞菌、粪产碱杆菌、阴道加特纳菌、卡它莫拉菌、莫拉克斯氏菌、CDC group EF-4a、特氏纤维单胞菌、戊糖片球菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、腐生葡萄球菌、模仿葡萄球菌、头状葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、鸡葡萄球菌、里昂葡萄球菌、山羊葡萄球菌、粘滑罗斯菌、麻疹孪生球菌、肺炎链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、牛链球菌Ⅰ型、乳房链球菌、少酸链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、黄肠球菌、浅绿气球菌、解酪蛋白巨大球菌、拥挤棒杆菌、人皮肤棒状杆菌、蜂房芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽胞杆菌。分离培养鉴定出12个科21个属48个种179株细菌,肠杆菌科是主要优势菌群,葡萄球菌科、肠球菌科、假单胞菌科、巴斯德菌科、链球菌科是次优势菌群。应用TaqMan mgb探针实时荧光定量PCR方法从灰仓鼠中检出167份核酸阳性标本,包括支原体、泰泽氏菌、空肠弯曲菌、CAR菌、幽门螺杆菌、肝螺杆菌、嗜肺巴斯德菌。TaqMan mgb探针实时荧光定量PCR检测结果显示支原体是最主要的优势菌群,泰泽氏菌、空肠弯曲菌、CAR菌、幽门螺杆菌、肝螺杆菌是次优势菌群。结论:TaqMan mgb探针实时荧光定量PCR结合分离培养能够更有效地监测分析灰仓鼠细菌多样性,获得更多更全面的微生物多样性信息,该信息对灰仓鼠质量控制标准的制定具有重要意义。研究结果为我国灰仓鼠微生物学监测以及质量标准的制定提供了科学依据。

关键词：灰仓鼠细菌多样性 TaqMan mgb探针实时荧光定量PCR 常规微生学方法分离培养生化鉴定监测分析

检测小麦线条花叶病毒的TaqMan mgb探针技术

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麦类作物学报 2009年第2期29卷 351-355页

作者：闻伟刚谭钟张吉红张颖宁波出入境检验检疫局浙江宁波315012

为给小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)的灵敏、稳定、快速检测提供依据,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与Taq Man mgb荧光探针,建立了WSMV的实时荧光RT-PCR检测方法... 详细信息

为给小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)的灵敏、稳定、快速检测提供依据,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与Taq Man mgb荧光探针,建立了WSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本研究设计的Taq Man mgb荧光探针对WSMV的检测具有很好的特异性,解决了因病毒不同分离物之间基因组变异较大、难以找到长片段保守序列来设计探针的困难。该方法无需任何PCR后处理,基因污染风险小。它与双抗体夹心酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高1 000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合于WSMV的快速检测。

关键词：小麦线条花叶病毒 TaqMan mgb探针实时荧光RT—PCR

Taq Man mgb探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒

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中国媒介生物学及控制杂志 2006年第2期17卷 86-89页

作者：段金花林立丰蔡松武卢文成郑夔易建荣广东省疾病预防控制中心消毒杀虫研究所广州510300

目的初步研究TaqManmgb探针实时聚合酶链反应(TaqManmgbRealtimePCR)检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性,建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Denguevirus,DV)鉴定方法。方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den2型病毒,设不同的感染蚊... 详细信息

目的初步研究TaqManmgb探针实时聚合酶链反应(TaqManmgbRealtimePCR)检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性,建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Denguevirus,DV)鉴定方法。方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den2型病毒,设不同的感染蚊虫浓度(只/500μl或只/1000μl)和不同的分组方法(不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只/组),利用一步法和二步法TaqManmgbPCR检测,根据荧光信号判断结果。结果二步法TaqManmgbPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为2只/500μl和3只/1000μl,一步法TaqManmgbPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为5只/500μl,蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响。结论TaqManmgb探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法,标本较好的处理方法为500μl标本处理液研磨20～30只/组,TaqManmgbRealtimePCR最好采用二步法。

关键词：白纹伊蚊登革-2型病毒 TaqMan mgb探针实时聚合酶链反应

鹦鹉热嗜性衣原体特异性TaqMan-mgb探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国人兽共患病学报 2010年第11期26卷 1041-1044,1058页

作者：冯悦张忠华龚福明柳陈坚昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650224

目的建立一种特异、灵敏、重复性好的鹦鹉热嗜性衣原体的TaqMan-mgb荧光定量PCR检测方法。方法利用鹦鹉热嗜性衣原体MOMP基因的特异保守序列设计引物和mgb探针,通过优化,获得最佳反应体系与反应条件,同时进行特异性、重复性、灵敏性评价... 详细信息

目的建立一种特异、灵敏、重复性好的鹦鹉热嗜性衣原体的TaqMan-mgb荧光定量PCR检测方法。方法利用鹦鹉热嗜性衣原体MOMP基因的特异保守序列设计引物和mgb探针,通过优化,获得最佳反应体系与反应条件,同时进行特异性、重复性、灵敏性评价与Spike-test实验进行临床应用性评价,利用该检测方法对禽鸟类粪便样品进行检测,并与常规PCR检测方法进行比较。结果该方法在0.01pg^100pg范围内线性相关系数为0.999,扩增效率为97.7%;对鹦鹉热嗜性衣原体菌株检测结果均呈现阳性,而非鹦鹉热嗜性衣原体菌株及其它衣原体菌株为阴性;重复性试验中,变异系数为0.317%~0.563%;检测灵敏性为0.01pg;Spike-test试验中最低检出量为25个EB;该方法对禽鸟类粪便样品的检出率为14.3%(40/282),高于常规PCR检测法的7.4%(21/282)。结论本文所建立的Taqman-mgb荧光定量PCR检测法是一种灵敏、高效、稳定,可在嗜性衣原体属中准确检测鹦鹉热嗜性衣原体的方法,该方法的建立更有意于今后对禽鸟类实施鹦鹉热的临床诊断与分子流行病学研究。

关键词：鹦鹉热嗜性衣原体荧光定量PCR mgb探针 MOMP基因