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靶向DICAR通过VCP介导MED12降解调控糖尿病心肌病

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靶向DICAR通过VCP介导Med12降解调控糖尿病心肌病

作者：孙芸薇武汉科技大学

学位级别：硕士

第一章DICAR-Tg小鼠抵抗DCM的发生与发展目的评价DICAR过表达能抑制糖尿病心肌病的发生与发展。方法用构建DICAR-Tg模型小鼠,并分别在野生型(WT)和DICAR-Tg小鼠模型上通过高脂饮食和尾静脉注射四氧嘧啶,建立糖尿病模型。在模型建立后分... 详细信息

第一章DICAR-Tg小鼠抵抗DCM的发生与发展目的评价DICAR过表达能抑制糖尿病心肌病的发生与发展。方法用构建DICAR-Tg模型小鼠,并分别在野生型(WT)和DICAR-Tg小鼠模型上通过高脂饮食和尾静脉注射四氧嘧啶,建立糖尿病模型。在模型建立后分别在1-6月,采用多普勒超声评价心功能。采用麦胚凝集素(wheat germ agglutnin,WGA)染色评价心肌重构,采用Masson三色染色法(masson-trichrome staining,Masson)染色法,计算心肌胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)来观察心肌胶原沉积。采用免疫组织化学染色观察III型胶原蛋白(collagen type III,col-III)的表达来评价心肌纤维化程度。为了探讨细胞焦亡在DICAR和DICAR-Tg+T2DM小鼠的心脏组织中的发生,采用western blot检测技术检测GSDMD、NLRP3、IL-1β等焦亡相关指标的表达变化。结果超声心动图显示,前5月的各项指标无统计学差异但有心功能减弱的趋势。在第6个月时,与WT组相比,WT+T2DM组小鼠心腔变大,左心室舒张末期内径(Left ventricular internal diastolic diameter,LVID.d)增大至4.14±0.12 mm,左心室收缩末期内径(Left ventricular internal systolic diameter,LVID.s)增大至3.14±0.10 mm;WT+T2DM组小鼠左心室舒张末期容积(Left ventricular end diastolic volume,LVEDv)增大至73.40±5.60,左心室收缩末期容积(Left ventricular end systolic volume,LVESv)增大至33.38±5.36,而左心室射血分数(Ejection Fraction,EF)降低至48.42±3.65%,左心室短轴缩短率(Fractional Shortening,FS)下降至24.27±2.26%。多普勒超声心动图检测结果提示,相较于WT组,WT+T2DM小鼠心脏结构出现异常,心脏收缩和舒张功能发生障碍。相比于WT+T2DM组,DICAR-Tg+T2DM组小鼠中,以上指标均发生了明显地改善,即DICRA过表达后使得小鼠的心腔有所缩小,EF和FS有所增强。WGA染色结果显示,WT+T2DM组与WT组相比,其心肌细胞明显肥大,而DICAR-Tg+T2DM组相较于WT+T2DM组有明显改善。Masson染色结果显示,相较于空白对照组WT,WT+T2DM组中小鼠心肌切片上心肌纤维化严重,而DICAR-Tg+T2DM组对此现象有明显改善。免疫组织化学染色结果显示,WT+T2DM组与WT组相比,col-III表达增加,而DICAR-Tg+T2DM组对此现象有明显改善。Western blot结果显示,DICAR小鼠中焦亡相关蛋白均上调且3月龄的上调更明显,DICAR-Tg+T2DM小鼠与WT+T2DM相比,焦亡受到抑制。结论DICAR的过表达改善了糖尿病小鼠的心脏功能障碍和重塑,并逆转了小鼠心肌细胞中的焦亡,DICAR可能是治疗DCM的靶基因。第二章寡核苷酸DICAR-JD抵抗DCM作用及机制研究目的观察DICAR-JD对T2DM诱导的心功能损伤的影响,探讨其可能的分子机制。方法在RNAfold中识别DICAR的二级结构。采用Ch IRP质谱(Chromatin Isolation by RNA Purification-mass,Ch IRP-MS)鉴定与DICAR相互作用的结合蛋白。在WT小鼠和db/db(type 2 diabetes mellitus)小鼠心脏组织中用western blot检测总含有valosin的蛋白质(valosin-containing protein,VCP)的表达,用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RIP)测定VCP蛋白并通过western blot评估IP的特异性。采用表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)分析测量DICAR和VCP之间的动力学速率常数。培养小鼠心肌细胞,m DICAR-JD和VCP-si RNA共转后,糖基化终末产物(advanced glycationend products,AGEs)(200μg/ml)处理48 h,用western blot检测技术细胞焦亡相关指标的表达变化。在DICAR+/-和DICARTg小鼠心肌组织western blot检测内质网的VCP蛋白的表达。使用液相色谱仪-质谱仪(liquid chromatograph-mass Spectrometer,LC-

关键词：心功能心肌重构 DICAR DCM 细胞焦亡 VCP MED12

枣黑斑病菌SSN3、SSN8、MED12和med13基因功能初步研究

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枣黑斑病菌SSN3、SSN8、MED12和MED13基因功能初步研究

作者：张亚龙河南农业大学

学位级别：硕士

枣树是中国第一大干果树种,也是重要的药用和经济林作物。真菌病害严重影响了枣产量与品质,其中链格孢（Alternaria alternata）是引起枣果实病害的重要病原,能够导致多种症状,如枣黑斑、枣褐皮、枣缩果等我们以其典型代表症状将该病害... 详细信息

枣树是中国第一大干果树种,也是重要的药用和经济林作物。真菌病害严重影响了枣产量与品质,其中链格孢（Alternaria alternata）是引起枣果实病害的重要病原,能够导致多种症状,如枣黑斑、枣褐皮、枣缩果等我们以其典型代表症状将该病害命名为枣黑斑病。2015年,链格孢（A.alternata）全基因组数据的公布,为其基因功能的定点研究、互作机制、致病机理等的研究奠定了基础。本文采用重叠PCR技术,利用原生质体转化的方法,将目的基因替换为潮霉素抗性基因hyg,敲除了枣黑斑病菌中编码CDK8激酶模块的SSN3、SSN8、MED12和med13这四个蛋白的基因,通过报告基因表达的抗性筛选及PCR检测,分别获得了这四个蛋白编码基因的缺失突变体,同时还得到了这四个编码基因缺失突变体的回补菌株。通过对以上缺失突变体及其回补菌株的表型分析发现:1)Ssn3基因缺失后,菌株生长受抑制,几乎无气生菌丝,产孢量显著下降（-98.56%）,孢子链变短,无分支,只有1～3个分生孢子串生;Ssn3基因缺失菌株在PDA培养基上菌落比野生型的颜色深,呈黑色,生长变慢,且对过氧化氢、氯化钠及SDS的压力胁迫比较敏感;突变株与野生菌株接种枣和梨果实的结果显示,相比野生型,其对前者的致病力下降了约66%,对后者的致病力下降约94%。但值得注意的是Ssn3基因缺失菌株引起梨果实病斑周围的果肉呈现浅蓝色。2)基因缺失菌株的表型分析显示其产孢量显著下降（-97.62%）,孢子链变短,无分支,只有1～3个孢子串生,几乎无气生菌丝;其在PDA培养基上的菌落颜色与Ssn3基因缺失突变体非常相似,比野生型的颜色深,呈黑色,生长变慢,但在5倍的YEG培养基上生长速率却略有增加且菌落呈灰白色;Ssn8基因缺失菌株对压力胁迫测试与Ssn3基因表型类似,也表现出敏感;枣、梨接种结果显示其致病力明显降低,分别下降了约67%和89%。3)MED12基因缺失菌株的表型分析显示其与Ssn3和Ssn8基因缺失表型类似,几乎无气生菌丝,生长速率变慢,产孢量显著下降（-98.08%）,分生孢子链变短（1～3个）,无分支;其在PDA和5倍YEG培养基上的菌落颜色同Ssn3基因缺失非常相似,呈黑色,生长变慢;对压力胁迫比较敏感;枣、梨接种结果与Ssn8基因缺失菌株类似,致病性明显降低,对枣果实的致病力下降了约71%,对梨果实的致病力下降了约90%。4)med13基因缺失菌株的表型分析揭示其与另外三个基因明显不同,medI3基因缺失菌株的产孢量显著下降（-91.24%）,分生孢子链变短,无分支,只有1到3个孢子,生长速率变慢;在PCA培养基上与其他三个基因缺失菌株表型类似,几乎无气生菌丝生长减慢,而其在PDA和5倍YEG培养上虽然生长减慢,但气生菌丝比较多、菌落颜色接近野生型;medI3基因缺失菌株对过氧化氢、氯化钠及SDS压力胁迫的敏感性相对于其他三个突变体的较弱;枣、梨接种结果发现,med13基因缺失菌株对枣果实的致病力较其他三个突变体略强（-43%）,而对梨果实的致病力与野生型无明显变化。通过本研究证明,A.alternata激酶模块CKM中的4个基因都参与调节分生孢子的发育,控制分生孢子链的伸长、分支,从而影响分生孢子的产量。此外,这4个基因对A.alternata菌丝的营养生长很重要,且参与调控A.的致病过程。

关键词：枣黑斑病链格孢 Ssn3 Ssn8 MED12 med13 基因敲除 CDK8激酶模块

29例子宫平滑肌肉瘤的临床资料回顾性分析及P53和MED12基因突变研究

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29例子宫平滑肌肉瘤的临床资料回顾性分析及P53和MED12基因突变研...

作者：孙成功山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的：子宫平滑肌肉瘤（Uterine leiomyosarcoma, ULMS）是一类少见的女性生殖系统恶性肿瘤,尽管发病率极低,但恶性程度在所有子宫体恶性肿瘤中居首位,易复发和远处转移。低发病率造成的临床和生物资料的缺乏给子宫平滑肌肉... 详细信息

研究背景与目的：子宫平滑肌肉瘤（Uterine leiomyosarcoma, ULMS）是一类少见的女性生殖系统恶性肿瘤,尽管发病率极低,但恶性程度在所有子宫体恶性肿瘤中居首位,易复发和远处转移。低发病率造成的临床和生物资料的缺乏给子宫平滑肌肉瘤的研究带来了不小困难,目前大多数研究结果局限于对临床资料的回顾性分析。多数学者认为子宫平滑肌肉瘤是一种“DNA不稳定肿瘤”,然而作为“DNA不稳定肿瘤”典型分子改变的P53基因突变仅见于25～43%的子宫平滑肌肉瘤病例,提示其发病机制可能与传统意义上的“DNA不稳定肿瘤”不尽相同。有人认为子宫平滑肌肉瘤源于良性子宫平滑肌瘤（Uterine leiomyoma, ULM）的恶性转化,但多数认为其直接起源于正常的子宫平滑肌细胞。有学者发现,MED12基因突变存在高达70%的ULM中,后来又经过多项研究证实,MED12突变被认为是ULM细胞的特征性改变。因此,本文旨在对ULMS和ULM病例的临床病理资料进行对比分析和预后影响因素检验,并比较检测所纳入病例的P53和MED12基因突变情况,为子宫平滑肌肉瘤的临床管理和预后估计提供参考借鉴,并探索其可能起源和发生发展机制。方法：本文收集山东大学齐鲁医院2005年1月～2015年12月间ULMS病例共29例并随机选取该时间段内ULM病例50例,通过院内病案检索系统及电话随访收集临床资料,对相应随访资料进行回顾性对比分析。应用SPSS22.0统计学软件对患者的发病年龄、绝经情况、初诊症状、生育情况、肿瘤直径、诊断率、手术方式、辅助治疗和临床分期等资料进行描述性统计和相关的检验统计及预后影响因素分析。研究对象的计量资料采用t检验,计数资料选择卡方检验;子宫平滑肌肉瘤患者的预后影响因素分析中,单因素利用Kaplan Meier生存曲线法和log-rank检验法。应用DNA直接测序的方法技术,对纳入的29例ULMS和50例ULM病变蜡块标本组织中P53和MED12基因突变情况进行检测并比较分析。各检验中均以0.05作为差异有统计学意义的p值界限。结果：1.临床特点：1.1发病年龄29例ULMS患者平均发病年龄明显高于50例ULM患者（46.90±10.6岁vs.42.0±8.1岁,p=0.023）。1.2绝经情况ULMS和ULM绝经率分别为27.6%（8/29）vs.6%（3/50）,前者高于后者（p＜0.01）。1.3初诊症状ULMS常见症状依次为“经量增多、经期延长”（34.6%）、“阴道不规则流血”（23.1%）、“下腹部不适”（17.2%）和“阴道流液”（3.4%）,另有17.2%的患者无明显症状于查体时发现,与ULM在初诊症状的构成上有显著差异（p=0.037）,且阴道不规则流血的发生率较后者高（23.1%vs.8.0%,p=0.029）。1.4生育情况ULMS和ULM患者的平均怀孕次数、分娩次数和流产次数均无显著差别（p=0.082,p=0.956,p=0.068）。1.5肿瘤直径及个数ULMS和ULM瘤体的平均直径无显著差异8.1±2.8cm vs.11.5±5.3cm（p=0.130）,而ULMS更倾向于单发（p=0.024）。1.6手术病理分期ULMS中FIGOI期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期病例分别占69.0%（20/29）、3.4%（1/29）、13.8%（4/29）、13.8%（4/29）。ULM均局限于子宫体。1.7肿瘤标志物ULMS患者中有11例行术前CA125检查,阳性率为27.3%（3/11）。1.8诊断率ULMS患者的术前诊断率和术中快速病理确诊率均明显低于ULM患者（23.1%vs.94%,p＜0.05;50%vs.100%,p＜0.05）,二者的术后常规病理确诊率均为100%。1.9治疗方案29例ULMS均行手术治疗切除子宫及双侧附件,其中23例行术后辅助化疗,2例行化疗和放疗。50例ULM患者中有14例行子宫切除（28%）,余36例行肌瘤挖除。1.10病理结果ULMS中高分化者占62.5%,低分化者占37.5%,淋巴结转移率为0%。PR、P53、P16、SMA、Desmin阳性率依次分别为50.0%（6/12）、55.6%（5/9）、66.7%（6/9）、100%（8/8）、77.8%（7/9）,Ki67平均阳性率为39.2%。2.生存率及预后影响因素分析随访27例ULMS患者1年、2年、5年的总体生存率为80.1%、62.2%、39.1%。手术病理分期为影响患者预后的唯一单因素,分期愈晚,预后愈差（p＜0.01）。3.P53和MED12基因突变率本文所纳入的ULMS和ULM病例组织标本中P53和MED12基因的突变率均有显著差异,分别为24.1%（7/29）vs.0%（0/50）（p＜0.01）和10.3%（3/29）vs.74%（37/50）（p＜0.01）。结论：1.ULMS平均发病年龄显著高于ULM, 二者的主

关键词：子宫平滑肌肉瘤子宫平滑肌瘤分期生存率 P53 MED12

良性转移性平滑肌瘤的病理学特征及基因表型分析

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中华病理学杂志 2020年第7期49卷 704-709页

作者：胡沙沙王丽丽赵涵李广起计晓彬信芳杰王继纲青岛大学附属医院病理科 266555

目的:探讨良性转移性平滑肌瘤(benign metastasizing leiomyoma,BML)的临床病理学特点、免疫表型及MED12基因突变情况。方法:收集青岛大学附属医院2012—2018年的9例BML患者资料,分析影像学资料及组织学形态,采用免疫组织化学EliVision... 详细信息

目的:探讨良性转移性平滑肌瘤(benign metastasizing leiomyoma,BML)的临床病理学特点、免疫表型及MED12基因突变情况。方法:收集青岛大学附属医院2012—2018年的9例BML患者资料,分析影像学资料及组织学形态,采用免疫组织化学EliVision法检测RB1、PTEN、ATRX、p16、p53等常见肿瘤驱动基因蛋白表达以及雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、CD34、延胡索酸水化酶(FH)、Ki-67等指标的表达情况,采用Sanger测序检测MED12基因第2外显子突变情况。结果:9例BML患者均为女性,年龄48~64岁,中位年龄55岁。所有患者均有子宫平滑肌瘤病史。镜下肿瘤细胞形态类似子宫良性平滑肌瘤,不具有恶性组织学特征。肿瘤细胞均表达ER和PR而不表达CD34,RB1、PTEN、ATRX、FH均为阳性(野生型),p16局灶阳性,p53阳性率均T(p.Phe64=)和错义突变c.196C>T(p.Pro66Ser)。结论:BML病理组织学及基因表型不同于平滑肌肉瘤以及普通子宫平滑肌瘤,进一步明确BML的基因表型,特别是肿瘤驱动基因蛋白表达及MED12基因突变情况,有助于明确BML的病理机制,辅助其与平滑肌肉瘤的鉴别诊断。

关键词：平滑肌瘤免疫组织化学表型 MED12

PYGO2相互作用蛋白的纯化鉴定及功能初探

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PYGO2相互作用蛋白的纯化鉴定及功能初探

作者：李洁厦门大学

学位级别：硕士

Pygopus（Pygo）是近年来发现的Wnt信号通路的新组分。在哺乳动物中Pygo有两个同源基因:Pygo1和Pygo2,后者的分布较为广泛。PYGO2蛋白定位于细胞核内,它有两个结构域,分别是位于C-端的PHD锌指结构域和位于N-端的NHD结构域。PYGO2通过PH... 详细信息

Pygopus（Pygo）是近年来发现的Wnt信号通路的新组分。在哺乳动物中Pygo有两个同源基因:Pygo1和Pygo2,后者的分布较为广泛。PYGO2蛋白定位于细胞核内,它有两个结构域,分别是位于C-端的PHD锌指结构域和位于N-端的NHD结构域。PYGO2通过PHD结构域与BCL9和β-catenin构成复合体,共同促进转录因子TCF对Wnt靶基因的转录激活。Pygo2 NHD结构域的功能尚不明确,有研究者认为它具有转录激活作用。近期研究显示,在哺乳动物中Pygo2可能还介导Wnt非依赖性的信号转导。串联亲和纯化技术（TAP）是在目的蛋白一端导入两个特异性的蛋白标签,经过两步亲和纯化,获得在生理条件下与目的蛋白相互作用的蛋白质,随后用质谱技术进行鉴定。它集合了亲和纯化和免疫共沉淀两种技术的优点,可以获得高纯度、高浓度的目的蛋白复合物,简便快捷。本研究利用串联亲和纯化和质谱联用的方法,从稳定表达外源性PYGO2蛋白（带ProtA和CBP标签）的DLD-1结肠癌细胞中,分离得到两个与PYGO2相互作用的新蛋白:MED12（mediator of RNA polymeraseⅡtranscription subunit 12）和PIK3C2A（Phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing alphapolypeptide）。进一步的免疫共沉淀实验证实,PYGO2通过NHD结构域与MED12结合。随后的荧光素酶实验显示,MED12过表达或用SiRNA阻遏MED12蛋白表达,对Pygo2 NHD结构域的转录激活活性均无明显影响;而当用siRNA阻遏MED12蛋白表达时,Pygo2 PHD结构域的转录激活活性显著增强,这暗示MED12可能会阻抑PHD结构域的转录激活活性,而这种活性很可能与染色质重塑有关。

关键词： PYGO2 串联亲和纯化 MED12