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感染与抗mda5抗体阳性皮肌炎关系的研究进展

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风湿病与关节炎 2024年第4期13卷 67-71页

作者：王婷朱丰林重庆市第十三人民医院重庆400053 重庆市中医院重庆400021

抗mda5抗体阳性皮肌炎(mda5+DM)所致快速进展的间质性肺病(RP-ILD),具有发病率低、死亡率高等特征,及早有效诊治可改善其预后。mda5+DM本身潜在肺结构改变、淋巴细胞减少及药物治疗等因素会导致患者机会性感染风险明显增加,是诊断过程... 详细信息

抗mda5抗体阳性皮肌炎(mda5+DM)所致快速进展的间质性肺病(RP-ILD),具有发病率低、死亡率高等特征,及早有效诊治可改善其预后。mda5+DM本身潜在肺结构改变、淋巴细胞减少及药物治疗等因素会导致患者机会性感染风险明显增加,是诊断过程中最常见干扰因素及死亡的关键因素。深入探讨感染与mda5+DM的关系不仅有利于阐述mda5+DM发病机制及预后,还可为治疗提供有效策略。

关键词：皮肌炎抗mda5抗体阳性皮肌炎感染 mda5 快速进展的间质性肺病新型冠状病毒

Pathogenesis of anti-melanoma differentiation-associated gene-5(mda5)dermatomyositis

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Chinese Medical Journal 2022年第18期135卷 2188-2190页

作者： Chenghua Weng Zhichun Liu Department of Rheumatology and Immunology The Second Affiliated Hospital of Soochow UniversitySuzhouJiangsu 215000China

Dermatomyositis(DM)is an idiopathic inflammatory myopathy,with typical cutaneous manifestations and muscle lesions,usually involving multiple *** with antimelanoma differentiation-associated gene-5(mda5)DM usually present with clinical amyopathic DM(CADM),which is characterized by a series of unique skin and systemic manifestations,including skin ulcer and interstitial lung disease(ILD).Among them,ILD is the most common complication of anti-mda5 DM,and in some cases,it can develop into rapidly progressive ILD(RP-ILD).^([1,2])

关键词： mda5 organs lesions

应用CRISPR/Cas9技术敲除mda5基因对新城疫及传染性法氏囊病毒复制的影响

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生物技术通报 2022年第11期38卷 90-96页

作者：钟菁孙玲玲张姝蒙园支怡飞涂黎晴徐天鹏濮黎萍陆阳清广西大学动物科学技术学院南宁530004

采用CRISPR/Cas9技术敲除DF-1的黑色素瘤分化相关基因5(melanoma-differentiation-associated gene 5,mda5),探索mda5基因对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建mda5敲除的DF-1细胞系;实时荧光定量PCR和免疫荧光法检测病毒感染mda5敲除细胞后病毒RNA水平、细胞病变情况及抗病毒相关基因mRNA水平等。获得mda5基因敲除的DF-1细胞;与对照组细胞相比,细胞形态、贴壁能力和增殖能力均无显著性差异;与对照组细胞相比,mda5基因敲除的DF-1细胞感染IBDV后,IFN-β和PKR表达显著性下调,CH25H的表达和病毒复制水平均无显著性差异;感染NDV后,IFN-β表达和病毒复制水平显著性下调,CH25H表达量显著性上调,PKR表达无显著性差异。CRISPR/Cas9技术建立mda5敲除的DF-1中,IFN-β虽然显著应答IBDV和NDV感染,但不能显著抑制病毒的复制,说明mda5并非抗病毒复制的关键模式识别受体。

关键词： mda5 新城疫病毒传染性法氏囊病毒 CRISPR/Cas9 基因敲除

Evolutionary selection on mda5 and LGP2 in the chicken preserves antiviral competence in the absence of RIG-I

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Journal of Genetics and Genomics 2019年第10期46卷 499-503页

作者： Ling Xu Dandan Yu Yu Fan Yi-Ping Liu Yong-Gang Yao Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences&Yunnan Province Kunming Institute of Zoology Center for Excellence in Animal Evolution and Genetics Chinese Academy of Sciences Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province Sichuan Agricultural University Kunming College of Life Science University of Chinese Academy of Sciences KIZ-CUHK Joint Laboratory of Bioresources and Molecular Research in Common Diseases Kunming Institute of ZoologyChinese Academy of Sciences

The pattern recognition receptors (PRRs) act as the first line of defense against pathogens and are common molecular targets in the conflict between viruses and their host (Tan et al.,2018).The RIG-I-like receptors (RLRs),including RIG-I (Yoneyama et al.,2004),mda5 (Andrejeva et al.,2004),and LGP2 (Saito et al.,2007),are PRRs and reside in the *** proteins recognize the RNA structures of different viral RNA *** RLRs have an intermediate RNA helicase domain that catalyzes ATP hydrolysis and a C-terminal domain (CTD).

关键词： mda5 hydrolysis absence

核酸识别受体mda5在DNA损伤修复中的作用与机制研究

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核酸识别受体MDA5在DNA损伤修复中的作用与机制研究

作者：金仁敬北京市结核病胸部肿瘤研究所

学位级别：硕士

DNA损伤修复功能完整是保持基因组稳定和完整的重要前提。DNA双链断裂（DNA double strand breaks,DSBs）是真核生物基因组最致命的威胁,需要被及时修复。当DSB发生后,主要依赖两种修复方式:直接连接损伤末端的易错的非同源末端连接（No... 详细信息

DNA损伤修复功能完整是保持基因组稳定和完整的重要前提。DNA双链断裂（DNA double strand breaks,DSBs）是真核生物基因组最致命的威胁,需要被及时修复。当DSB发生后,主要依赖两种修复方式:直接连接损伤末端的易错的非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）,以及以同源姐妹染色单体作为模板的无错修复方式—同源重组修复（Homologous recombination,HR）。参与基因组完整性的DNA损伤反应以及有丝分裂的功能失调,均可导致染色质和核酸释放到细胞质之中,激活细胞溶质RIG-I样受体家族（RIG-I-like receptors,RLRs）核酸传感途径,其中视黄酸诱导基因I（Retinoic Acid Inducible Gene 1,RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白5（Melanoma differentiation-associated gene 5,mda5）传感器感应胞质双链RNA（double-strand RNA,ds RNA）以及病毒RNA感染,诱导细胞自主性干扰素和促炎细胞因子的产生,启动抗肿瘤免疫应答以及宿主防御性抗病毒反应。目前DNA损伤修复反应与RIG-I传感途径介导的先天免疫途径之间的相关研究程度已较为深刻,但论DNA损伤修复反应与mda5传感信号途径之间的调控机制尚不清楚。本篇文章发现,通过DNA损伤处理,包括电离辐射（Ionizing Radiation,IR）、致DNA损伤的化疗药物以及DNA损伤修复抑制剂的诱导,可触发胞质ds RNA及其特异性识别感受器mda5的产生,介导后续先天免疫途径中的I型干扰素（Type I interferons,I-IFN）反应。接下来,我们发现在DSB处理下,mda5与DSB标志物组蛋白γH2AX以及RAD51共定位,提示mda5可能参与DSB后的修复机制。PARP1是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶的切割底物,更是DNA单链或双链断裂后修复过程的重要蛋白。通过质粒转染的方式使mda5过表达,我们发现mda5与PARP1具有明显的相互作用。最后,通过mda5基因过表达并进行蛋白质谱技术鉴定筛选,选取可能与mda5有紧密关联的DNA损伤修复信号分子,我们发现ATP依赖性RNA解旋酶DDX3X占据mda5众多结合位点序列。值得注意的是,多项研究表明DDX3X的破坏影响DNA损伤反应,并且以依赖PARP1的方式被招募至DNA损伤位点,以上现象均暗示DDX3X或许可以作为潜在靶点影响mda5相关传感免疫途径。综上,我们阐述DNA在以双链断裂的形式损伤时,mda5在其中发挥重要作用,并且可能与HR修复过程中的重要蛋白PARP1共同调节先天免疫反应,以依赖mda5核酸传感途径的方式介导干扰素及促炎细胞因子的产生,进一步揭示DNA损伤修复应答与抗肿瘤免疫应答之间的内在联系。

关键词： mda5 DNA损伤与修复 PARP1

mda5调控肺泡上皮细胞程序性死亡参与ARDS的机制探究

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MDA5调控肺泡上皮细胞程序性死亡参与ARDS的机制探究

作者：宋杰中南大学

学位级别：硕士

背景及目的:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是呼吸系统最严重的病理状态之一,表现为急性发作的非心源性肺水肿、低氧血症以及需要机械通气支持。ARDS的发病率和死亡率居高不下,对公众健康造成严重威胁。... 详细信息

背景及目的:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是呼吸系统最严重的病理状态之一,表现为急性发作的非心源性肺水肿、低氧血症以及需要机械通气支持。ARDS的发病率和死亡率居高不下,对公众健康造成严重威胁。ARDS患者的主要病理变化为弥漫性肺泡损伤,其发生机制复杂,被认为与炎症细胞聚集、氧化应激、细胞死亡等有关。ARDS发生时,肺部炎症细胞强烈活化,释放过量促炎细胞因子,产生细胞因子风暴,导致肺泡上皮细胞大量损伤或死亡,造成弥漫性肺泡损害和急性肺损伤(acute lung injury,ALI)。肺泡上皮细胞损伤的机制亟待充分阐明。程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)是一系列受到机体严格调控的细胞死亡形式的统称,主要包括凋亡、坏死性凋亡和焦亡等死亡形式。PCD密切参与许多疾病如感染、无菌炎症、自身免疫病、肿瘤等的发生发展。近期研究提示,肺泡上皮细胞的程序性死亡在ARDS进展中发挥重要作用,寻找肺泡上皮细胞程序性死亡的关键调节分子有助于为ARDS治疗提供潜在的靶点。黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5,mda5)是一种位于胞质内的干扰素诱导蛋白,是宿主识别胞内双链RNA的重要核酸感受器之一,被证明参与肺泡上皮细胞中包括新冠感染在内的抗病毒免疫反应。近期研究表明,mda5能促进ARDS患者的巨噬细胞向M1促炎表型极化,也能促进多种肿瘤细胞的凋亡和生长抑制。蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)和Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA-binding protein 1,ZBP1)与mda5同属于干扰素诱导的核酸感受器,已被证实能够调控多种PCD的发生和转换。mda5是否具有类似的调控PCD的作用,以及mda5是否参与了ARDS的发生发展目前尚无报道。因此,本研究旨在从整体动物水平和细胞水平研究mda5对ARDS时肺泡上皮细胞程序性死亡的调控作用,探讨mda5参与ARDS发病机理中的分子机制。方法:(1)聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,poly(I:C))和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)序贯刺激建立细胞因子风暴动物模型。高倍镜下在小鼠脾组织切片中寻找嗜血现象以确定巨噬细胞活化,对小鼠肺组织切片进行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,简称HE染色)和肺组织病理学评分以评估小鼠肺损伤程度,RT-q PCR和蛋白质免疫印迹检测小鼠肺组织的mda5基因转录水平和蛋白表达水平,RT-q PCR检测小鼠肺组织的炎症相关基因如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、干扰素(interferon,IFN)-γ、CC趋化因子配体(CC chemokine ligand,CCL)8、白介素(Interleukin,IL)-6、ZBP1和PKR的基因转录水平,RT-q PCR检测小鼠肺组织的死亡相关通路基因如CASP8和FADD样凋亡调节因子(CASP8 and FADD like apoptosis regulator,CFLAR)、凋亡相关因子(factor-related apoptosis,Fas)、凋亡相关因子配体(factor-related apoptosis ligand,Fas L)、BH3相互作用域死亡激动因子(BH3-Interacting domain death agonist,Bid)、Bcl2-相关X蛋白质(Bcl2-Associated X,Bax)的基因转录水平,免疫荧光检测小鼠坏死性凋亡指标磷酸化受体交互作用蛋白激酶3(phosphorylated receptor-interacting protein kinase 3,p-RIPK3)和磷酸化混合连接激酶结构域样蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein,p-MLKL)的表达水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)染色检测小鼠肺组织的凋亡水平。(2)TNF-α和IFN-γ协同刺激小鼠肺上皮细胞12(murine lung epithelial-12,MLE12)模拟ARDS患者体内的细胞因子风暴,检测小鼠肺泡上皮细胞的死亡水平和死亡形式。向野生型MLE12细胞系中转染小发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)-M

关键词： ARDS 程序性细胞死亡 mda5 凋亡坏死性凋亡

mda5-/-小鼠的构建及STING-/-小鼠对H9N2亚型AIV天然免疫应答研究

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MDA5-/-小鼠的构建及STING-/-小鼠对H9N2亚型AIV天然免疫应答研究

作者：田璐新疆农业大学

学位级别：硕士

mda5作为RLRs蛋白家族成员,能特异性的识别较长的双链RNA,激活体内的信号通路,促进I型干扰素的表达,在天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠mda5基因第一外显子区域选择一段序列作为靶序列,将含有靶序列的sg... 详细信息

mda5作为RLRs蛋白家族成员,能特异性的识别较长的双链RNA,激活体内的信号通路,促进I型干扰素的表达,在天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠mda5基因第一外显子区域选择一段序列作为靶序列,将含有靶序列的sg RNA和Cas9质粒的体外转录产物显微注射至C57BL/6近交系小鼠的受精卵中,8只F0代首建鼠中5号小鼠为mda5基因敲除纯合小鼠;将其与野生型(WT)小鼠合笼繁育出mda5小鼠,再通过全同胞合笼交配的方式获得纯合子小鼠。基因组PCR后检测显示F2代小鼠中有4只纯合子小鼠,RT-PCR结果显示mda5各脏器中mda5基因均未表达,表明mda5基因敲除小鼠模型构建成功,为研究mda5在天然免疫应答和抗病毒机制提供有价值的模型。干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene,STING)是参与机体固有免疫应答的重要接头蛋白。胞质DNA感受器c GAS与下游接头蛋白STING一起形成信号通路是STING激活信号通路的主要途径。c GAS-STING信号通路主要识别DNA病毒,但近几年有研究发现,RNA病毒感染可以激活mt DNA-c GAS-STING信号通路。本研究以STING小鼠为模型,通过H9N2禽流感病毒感染实验来探究STING在抗RNA病毒感染引起的天然免疫应答中的作用。分别选取6周龄的STING小鼠和WT小鼠各6只,分为两组:免疫组6只,未免疫组6只;免疫组小鼠以皮内多点注射的方式接种H9N2全病毒灭活疫苗,一免21天后加强免疫;二免后14天,免疫组和未免疫组小鼠以滴鼻感染的方式接种H9N2亚型禽流感病毒ck/HLJ/3/00毒株。攻毒后第3天和第6天四组小鼠中各选取3只,以眼眶采血的方式采血,HI检测免疫攻毒组中STING小鼠和WT小鼠抗体效价;采取肺组织,一部分用于HE染色观察小鼠肺组织病变情况,一部分用于荧光定量PCR检测STING下游信号分子、炎性因子、干扰素及抗病毒蛋白表达。结果:HI抗体效价:攻毒后第3天和第6天STING免疫组小鼠血清中抗体水平均低于WT组;肺组织病毒滴度:攻毒后第3天和第6天STING未免攻毒组小鼠体内病毒滴度均高于WT小鼠;荧光定量PCR检测结果:STING未免疫组小鼠中STING信号通路上相关蛋白(c GAS、DDX41、MAVS、Mx1)和因子(IRF3、NF-κB、IL-1β)、IFN-β、ISG15的m RNA表达情况除抑炎性因子IL-10外均低于WT组。结果表明STING基因敲除之后,STING介导的天然免疫反应受到抑制,下游信号通路受阻,不能抑制流感病毒的复制,抗病毒感染能力减弱。

关键词： CRISPR/Cas9 STING mda5 基因敲除小鼠模型 H9N2 天然免疫应答

短杆菌肽A促进mda5介导的干扰素信号通路的机制研究

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短杆菌肽A促进MDA5介导的干扰素信号通路的机制研究

作者：李笑天津大学

学位级别：硕士

近年的研究发现,干扰素通路在癌症治疗中发挥积极的作用,杀灭癌细胞的药物可以通过mda5介导的干扰素信号通路的激活发挥其功能的。研究干扰素通路的调控机制、利用外源手段对干扰素通路进行调控,这些在宿主抗病原微生物侵染、癌症治疗... 详细信息

近年的研究发现,干扰素通路在癌症治疗中发挥积极的作用,杀灭癌细胞的药物可以通过mda5介导的干扰素信号通路的激活发挥其功能的。研究干扰素通路的调控机制、利用外源手段对干扰素通路进行调控,这些在宿主抗病原微生物侵染、癌症治疗等领域中有着广泛的应用需求。本课题以mda5蛋白的已有结构(PDB:4GL2)为起点,利用Molecular Operating Environment(MOE)数据库进行高通量筛选,通过将所有mda5蛋白质与小分子配体复合物的结构推导出来的统计评分函数,来评估mda5蛋白质与小分子配体相互作用的强度。通过对分数排名靠前的9个化合物进行的功能初筛,使用RT-q PCR方法鉴定出了一个可以对mda5介导的干扰素信号通路起到激活作用的化合物,即化合物短杆菌肽A(Gramicidin A)。已知Gramicidin A由短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的培养物提取而成,具有抗菌杀菌的作用,目前为止对于Gramicidin A对信号通路的研究只有Gramicidin A对ERK信号通路的影响。我们利用RT-q PCR实验,荧光素酶实验等多种手段,对Gramicidin A上调干扰素通路激活进行研究。前期实验发现,Gramicidin A对mda5介导的干扰素通路激活表现出浓度依赖作用。而且实验发现,Gramicidin A能够有效提高在不同时间点的干扰素的激活情况。进一步实验发现,Gramicidin A对RIG-I和c GAS介导的干扰素信号通路都具有显著的促进作用,而对RIG-I和mda5的共同下游接头蛋白MAVS没有影响。因为c GAS可以识别细胞质DNA,而mda5和RIG-I可以识别细胞质ds RNA,我们猜测这些DNA和RNA可能是从如线粒体这样的细胞器内泄漏出来的,而且有报道称Gramicidin A能对线粒体产生毒性。所以这些结果提示,Gramicidin A可能通过改变细胞内DNA、RNA的代谢,增强了识别受体的活性而对干扰素信号通路的激活发挥促进作用。通过使用结晶紫染色、MTT、活体细胞线粒体损伤/氧化荧光测定等实验方法,来定性或定量化合物Gramicidin A对细胞和线粒体的损伤情况。然而同样能对线粒体造成损伤的化合物rotenone却不能对mda5介导的干扰素信号通路起到激活作用,这表明Gramicidin A对mda5、RIG-I和c GAS的激活,不是通过破坏线粒体实现的,可能存在更直接的作用机制。此外我们又对从短芽孢杆菌的培养物中提取出来的另一类物质Gramicidin S进行了研究,发现Gramicidin S不能激活mda5介导的干扰素信号通路。总而言之,通过我们不断探究mda5介导的干扰素信号通路激活的机制,发现化合物Gramicidin A虽然可以对线粒体造成损伤,但是并不是激活mda5介导的干扰素信号通路的原因,Gramicidin A可能与WT mda5的某些位点结合具有特异性。后续该研究将揭示出Gramicidin A与细胞相互作用的新机制,为体外、临床上调控干扰素通路增添新的可能的手段。

关键词： mda5 干扰素通路短杆菌肽A 双链RNA

HSPA6负调控mda5/RIG-I-MAVS介导的干扰素通路激活的机制研究

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HSPA6负调控MDA5/RIG-I-MAVS介导的干扰素通路激活的机制研究

作者：冀晓馨天津大学

学位级别：硕士

干扰素信号通路作为天然免疫系统的重要组成部分,在抗病毒免疫应答等方面发挥着重要作用。在没有病原体感染的情况下,干扰素通路可以被突变的模式识别受体特异性激活,比如被功能获得性突变受体(GOF PRRs)激活。据报道,人源mda5(模式识... 详细信息

干扰素信号通路作为天然免疫系统的重要组成部分,在抗病毒免疫应答等方面发挥着重要作用。在没有病原体感染的情况下,干扰素通路可以被突变的模式识别受体特异性激活,比如被功能获得性突变受体(GOF PRRs)激活。据报道,人源mda5(模式识别受体的一种)的功能获得性突变体可以识别自身带有IR-Alu结构的双链RNA,引起下游干扰素信号激活。这种突变导致的干扰素异常激活会引发自身免疫性疾病,如Aicardi-Goutières综合症。并且,由于其他原因引起的干扰素异常激活也会导致系统性红斑狼疮和银屑病等自身免疫疾病。因此,使干扰素保持在正常水平以维持细胞环境稳态对机体健康是非常重要的。鉴于干扰素正常表达的重要性,针对干扰素调控的研究也越来越受到关注。许多研究已经报道了相关蛋白有正向或负向调节干扰素信号传导通路的功能。本课题研究中,我们也发现了一种热休克蛋白(HSPs),它在RLRs(模式识别受体中的一类)介导的干扰素通路激活中发挥了重要的调节功能。在本项研究中,我们利用功能获得性突变的mda5受体(GOF mda5)特异性地激活干扰素,筛选出在干扰素激活过程中被特异性上调的基因,即编码热休克蛋白6的基因HSPA6。通过对HSPA6的功能研究,我们发现上调的HSPA6蛋白对干扰素通路的激活有负向调节作用。并且在HSPA6敲除的细胞中,我们发现RLRs介导的干扰素的激活被显著上调了。对于以上发现我们进行了相关的机制研究,实验证明了GOF RLRs对HSPA6的上调不依赖于下游蛋白MAVS,而可能依赖于GOF RLRs激活时形成的丝状结构。此外,HSP40参与了HSPA6的上调,但这个过程并没有激活HSF1对HSPA6的转录。对HSPA6负向调控干扰素激活的机制研究表明GOF mda5与HSPA6存在相互作用。HSPA6可能降低了RLRs介导的干扰素通路中TBK1和IRF3的磷酸化水平。我们进一步推测HSPA6可能改变了RLRs和MAVS的聚集状态。总之,我们的研究结果表明,RLRs介导的干扰素激活会使HSPA6表达上调,同时HSPA6又在RLRs激活干扰素的过程中发挥着重要的调节功能,即HSPA6在一定程度上减弱了干扰素的异常激活。并且,我们探讨了HSPA6被上调以及发挥负向调控的分子机制。通过本项目的研究,将建立起热激蛋白与RLRs-MAVS激活干扰素通路的内在联系。本课题的研究也将进一步推动对干扰素信号通路调控方式以及机制的理解,并且为治疗自身免疫疾病提供新的思路。

关键词：干扰素通路 mda5 RIG-I HSPA6