MDA5调控肺泡上皮细胞程序性死亡参与ARDS的机制探究

作     者：宋杰 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张华莉

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：ARDS 程序性细胞死亡 MDA5 凋亡 坏死性凋亡 

摘      要：背景及目的:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是呼吸系统最严重的病理状态之一,表现为急性发作的非心源性肺水肿、低氧血症以及需要机械通气支持。ARDS的发病率和死亡率居高不下,对公众健康造成严重威胁。ARDS患者的主要病理变化为弥漫性肺泡损伤,其发生机制复杂,被认为与炎症细胞聚集、氧化应激、细胞死亡等有关。ARDS发生时,肺部炎症细胞强烈活化,释放过量促炎细胞因子,产生细胞因子风暴,导致肺泡上皮细胞大量损伤或死亡,造成弥漫性肺泡损害和急性肺损伤(acute lung injury,ALI)。肺泡上皮细胞损伤的机制亟待充分阐明。程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)是一系列受到机体严格调控的细胞死亡形式的统称,主要包括凋亡、坏死性凋亡和焦亡等死亡形式。PCD密切参与许多疾病如感染、无菌炎症、自身免疫病、肿瘤等的发生发展。近期研究提示,肺泡上皮细胞的程序性死亡在ARDS进展中发挥重要作用,寻找肺泡上皮细胞程序性死亡的关键调节分子有助于为ARDS治疗提供潜在的靶点。黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)是一种位于胞质内的干扰素诱导蛋白,是宿主识别胞内双链RNA的重要核酸感受器之一,被证明参与肺泡上皮细胞中包括新冠感染在内的抗病毒免疫反应。近期研究表明,MDA5能促进ARDS患者的巨噬细胞向M1促炎表型极化,也能促进多种肿瘤细胞的凋亡和生长抑制。蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)和Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA-binding protein 1,ZBP1)与MDA5同属于干扰素诱导的核酸感受器,已被证实能够调控多种PCD的发生和转换。MDA5是否具有类似的调控PCD的作用,以及MDA5是否参与了ARDS的发生发展目前尚无报道。因此,本研究旨在从整体动物水平和细胞水平研究MDA5对ARDS时肺泡上皮细胞程序性死亡的调控作用,探讨MDA5参与ARDS发病机理中的分子机制。方法:(1)聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,poly(I:C))和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)序贯刺激建立细胞因子风暴动物模型。高倍镜下在小鼠脾组织切片中寻找嗜血现象以确定巨噬细胞活化,对小鼠肺组织切片进行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,简称HE染色)和肺组织病理学评分以评估小鼠肺损伤程度,RT-q PCR和蛋白质免疫印迹检测小鼠肺组织的MDA5基因转录水平和蛋白表达水平,RT-q PCR检测小鼠肺组织的炎症相关基因如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、干扰素(interferon,IFN)-γ、CC趋化因子配体(CC chemokine ligand,CCL)8、白介素(Interleukin,IL)-6、ZBP1和PKR的基因转录水平,RT-q PCR检测小鼠肺组织的死亡相关通路基因如CASP8和FADD样凋亡调节因子(CASP8 and FADD like apoptosis regulator,CFLAR)、凋亡相关因子(factor-related apoptosis,Fas)、凋亡相关因子配体(factor-related apoptosis ligand,Fas L)、BH3相互作用域死亡激动因子(BH3-Interacting domain death agonist,Bid)、Bcl2-相关X蛋白质(Bcl2-Associated X,Bax)的基因转录水平,免疫荧光检测小鼠坏死性凋亡指标磷酸化受体交互作用蛋白激酶3(phosphorylated receptor-interacting protein kinase 3,p-RIPK3)和磷酸化混合连接激酶结构域样蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein,p-MLKL)的表达水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)染色检测小鼠肺组织的凋亡水平。(2)TNF-α和IFN-γ协同刺激小鼠肺上皮细胞12(murine lung epithelial-12,MLE12)模拟ARDS患者体内的细胞因子风暴,检测小鼠肺泡上皮细胞的死亡水平和死亡形式。向野生型MLE12细胞系中转染小发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)-M