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中国比较医学杂志 2024年第3期34卷 27-35页

作者：马立威姚宏玉陈哲倪世宇陈颂李京刘吉成齐齐哈尔医学院医药科学研究院黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔医学院药学院黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔医学院公共卫生学院黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔医学院附属第五医院黑龙江大庆163001 齐齐哈尔医学院附属第三医院黑龙江齐齐哈尔161099

目的探讨PI3k/Akt通路在大戟大枣汤(decoction of Euphorbia fischeriana *** jujuba,DEFSJ)抗雌激素受体(ER)阴性(-)和ER阳性(+)乳腺癌中的调控作用,为乳腺癌的针对性治疗提供参考。方法制备DEFSJ提取液,采用UHPLC-Triple Quad仪进行质控分析。DEFSJ含药血清(containing serum,CS)依照体外血清药理学方法进行获取,乳腺癌(ER-)mda-mb-453和(ER+)MCF-7细胞分别用不同浓度DEFSJ-CS干预48 h。流式细胞术检测细胞周期分布,DNA ladder实验评估细胞凋亡程度,Western blot法检测PI3k/Akt通路相关蛋白表达,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测FoxO3a、FoxO1a及Bim mRNA表达;激光共聚焦显微镜观察FoxO3a蛋白核转位。结果UPLC对5批DEFSJ提取物进行了分析,结果表明制备工艺可行,质量可控,保证了药理学实验结果的准确性。体外实验中发现,DEFSJ-CS能阻断细胞在G2/M期(P细胞凋亡梯带;与阴性对照组比较,DEFSJ-CS能使p-PI3k、p-Akt、p-FoxO3a及p-FoxO1a蛋白表达降低(P细胞中FoxO3a蛋白呈现显著的核转位变化;且各数据结果均显示DEFSJ-CS对(ER-)mda-mb-453细胞比对(ER+)MCF-7细胞作用效果更好。结论PI3k/Akt通路参与了大戟大枣汤抗乳腺癌作用的调控,作用效果因乳腺癌表型差异而不同。

关键词：狼毒大戟 mda-mb-453细胞 MCF-7细胞 PI3k/Akt通路

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赫赛汀及9-顺式视黄酸对乳腺癌联合抑制作用

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中国公共卫生 2008年第3期24卷 311-312页

作者：郎海滨糜漫天朱俊东第三军医大学营养与食品卫生学教研室重庆市营养与食品安全重点实验室重庆400038

目的探讨赫赛汀联合9-顺式视黄酸对ErbB2阳性乳腺癌细胞周期进程及分布的影响及其相应的分子机制。方法利用流式细胞仪检测经赫赛汀、9-顺式视黄酸单独和联合作用后,癌基因(ErbB2/neu)阳性的mda-mb-453乳腺癌细胞周期进程和分布的变化... 详细信息

目的探讨赫赛汀联合9-顺式视黄酸对ErbB2阳性乳腺癌细胞周期进程及分布的影响及其相应的分子机制。方法利用流式细胞仪检测经赫赛汀、9-顺式视黄酸单独和联合作用后,癌基因(ErbB2/neu)阳性的mda-mb-453乳腺癌细胞周期进程和分布的变化。在此基础上,利用免疫印记和半定量PCR法对CDK2、CyclinE、P27的表达进行检测,同时利用免疫沉淀法检测CyclinE/CDK2结合力的变化。结果与对照组比较,一定剂量的赫赛汀和9-顺式视黄酸可将mda-mb-453细胞的周期进程阻遏于G0/G1期从而抑制其增殖活性。经2者联合作用后,CyclinE、CDK2的表达较对照组均有所下降,其中以CDK2的变化最为明显,而P27蛋白表达则明显升高。同时,2者联合作用还能有效降低CyclinE/CDK2的结合能力。结论赫赛汀和9-顺式视黄酸可在体外分别通过改变CyclinE、CDK2和P27的表达和活性起到协同抑制HrbB2/neu阳性乳腺癌的目的。

关键词：赫赛汀 9-顺式视黄酸 ErbB2 细胞周期 mda-mb-453细胞乳腺癌

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桑葚花色苷的提取及其抗乳腺癌作用研究

桑葚花色苷的提取及其抗乳腺癌作用研究

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作者：王湛第三军医大学

学位级别：硕士

桑葚又称桑果、桑枣,为桑科落叶乔木桑树的成熟果穗,味甘性寒,酸甜汁多,是人们常食的水果之一。传统中医认为桑葚既可入食,又可入药,味甘酸,性微寒,入心、肝、肾,为滋补强壮、养心益智佳果。现代营养医学研究表明,桑葚具有增强免疫功能... 详细信息

桑葚又称桑果、桑枣,为桑科落叶乔木桑树的成熟果穗,味甘性寒,酸甜汁多,是人们常食的水果之一。传统中医认为桑葚既可入食,又可入药,味甘酸,性微寒,入心、肝、肾,为滋补强壮、养心益智佳果。现代营养医学研究表明,桑葚具有增强免疫功能,促进造血细胞的生长,预防动脉粥样硬化,促进新陈代谢等作用,具有一定的药理学价值。桑葚具备药理活性的基础在于其独特的食物成分,特别是某些生物活性物质。研究表明,成熟桑葚含有丰富的花色苷化合物,膳食花色苷是一类广泛存在于蔬菜、水果等食物中的天然色素,属植物化学素中的黄酮类化合物,流行病学调查和实验研究证实,膳食花色苷化合物具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等广泛、优良的生物学效应,特别是其抗肿瘤活性以天然、低毒、高效而备受关注。由此可以推测,桑葚的药理学活性可能在于其含有丰富的花色苷化合物,但相关研究尚未见报道,因此提取和纯化桑葚花色苷化合物,并研究其药理活性及相关作用机制,对于揭示桑葚的药理活性本质及进一步开发利用桑葚资源均具有一定的意义和价值。乳腺癌是严重危害妇女健康的常见恶性肿瘤,是引起妇女死亡的常见肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势且趋向年轻化,如何有效防治乳腺癌,特别是通过日常膳食途径防治乳腺癌,已成为国内外营养学领域一个重要研究方向。本课题研究了桑葚花色苷的提取和纯化工艺,并对提取和纯化过程中的各项重要参数进行了优化,获得了桑葚花色苷提取和纯化的最佳方案,由此得到较高含量的花色苷提取物;在此基础上,本课题探讨了桑葚花色苷提取物的抗乳腺癌效应,通过体外细胞增殖检测、凋亡流式分析、线粒体膜电位的激光共聚焦扫描显微镜观察等实验,以及体内乳腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤实验,研究和评价了桑葚花色苷提取物的体内外抗乳腺癌效应,并对可能的作用机制进行初步的探讨。本课题对于探讨通过膳食途径防治乳腺癌以及开发利用桑葚资源均具有一定的科学意义。本课题研究结果和结论如下: 1.确定了超声辅助乙醇萃取法提取桑葚花色苷和大孔树脂吸附纯化的工艺流程。提取工艺:成熟天然桑葚经洗涤、打碎、冷冻干燥,得到冷冻桑葚干粉;将桑葚干粉溶于酸化乙醇溶液中,超声辅助提取,提取液以5000 rpm离心10 min,取上清液;离心后提取液进行真空抽滤,滤液用旋转蒸发器旋蒸除去乙醇,再用石油醚萃取3次除去脂类,最后利用真空抽滤,得到桑葚花色苷粗提物水溶液。将此溶液冷冻于-70°C冰箱,冷冻2 h后放入冷冻干燥机冷冻干燥为提取物干粉。以Amberlite? XAD7HP型大孔吸附树脂对桑葚花色苷提取物进行纯化,并对提取和纯化过程中的重要参数进行了优化。确定了提取液乙醇浓度为70%和pH值为3.0,料液比为1:20,提取时间为80 min,纯化过程中进液流速为2.0 ml/min,洗脱流速为1.0 ml/min。利用以上提取和纯化方法及参数,最终获得桑葚花色苷提取物其花色苷总含量为(41.8±4.8)%,产品获得率为(2.6±0.7)%。 2.以前期获得的桑葚花色苷提取物作用于乳腺癌细胞mda-mb-231、mda-mb-453和MCF-7,细胞生长状态及形态观察可见,100、150和200 mg/ml桑葚花色苷作用可产生显著影响,表现为三种乳腺癌细胞的生长密度明显稀疏,细胞排列紊乱,形态异常,大量细胞结构出现缺损,细胞皱缩变圆,或出现肿胀,或胞质凝缩,众多细胞与其周边细胞分离,贴壁性下降,甚至离开瓶壁漂浮到培养基中,出现大量漂浮细胞和细胞碎片,表明桑葚花色苷提取物作用可显著影响三种乳腺癌细胞的生长和形态。CCK-8法细胞增殖活力检测结果表明,100、150和200 mg/ml桑葚花色苷提取物作用可使三种乳腺癌细胞增殖活性显著降低,且随作用浓度的增加降低程度增加,显示出剂量-效应关系,表明桑葚花色苷提取物作用可显著抑制乳腺癌细胞的增殖,显示出较强的体外细胞毒性,具有体外抗乳腺癌效应。 3.以50、100和150 mg/ml桑葚花色苷提取物作用三种乳腺癌mda-mb-231、mda-mb-453和MCF-7细胞24 h,采用Annexin V/PI双染流式细胞凋亡分析,结果显示,三种乳腺癌细胞凋亡率均升高,显示出促凋亡效应,且具有剂量-效应关系,100和150 mg/ml组凋亡率显著增高,表明桑葚花色苷提取物可诱导乳腺癌细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。利用JC-1探针和激光共聚焦扫描显微镜检测线粒体膜电位,结果显示,桑葚花色苷提取物作用24 h,可使mda-mb-453细胞线粒体膜电位显著下降,表现为红色/绿色荧光的比值降低,表明桑葚花色苷提取物可降低乳腺癌细胞线粒体膜电位,促发凋亡发生。 4.利用BALB/c裸鼠制造乳腺癌移植瘤动物模型,以50、100和200 mg/kg/d的桑葚花色苷提取物进行膳食干预,观察其体内抑瘤效应。实验结果显示,各组裸鼠饲

关键词：桑葚花色苷提取超声辅助纯化大孔树脂参数优化抗癌乳腺癌 MCF-7细胞 mda-mb-453细胞 mda-mb-231细胞细胞形态细胞活力 CCK-8 裸鼠移植瘤细胞凋亡流式细胞分析线粒体膜电位 JC-1 激光共聚焦扫描显微镜

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Herceptin联合9-顺式视黄酸对HER2/neu阳性乳腺癌协同抑制效应及机制研究

Herceptin联合9-顺式视黄酸对HER2/neu阳性乳腺癌协同抑制效应及...

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作者：柴雅明第三军医大学

学位级别：硕士

癌基因ErbB2,又称为HER2/neu,是人类肿瘤中发生改变频率最高的癌基因之一,编码一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,属表皮生长因子受体家族成员,其异常扩增与表达与乳腺癌的发生、发展密切相关,是乳腺癌的一个重要分子标志物和治疗靶。... 详细信息

癌基因ErbB2,又称为HER2/neu,是人类肿瘤中发生改变频率最高的癌基因之一,编码一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,属表皮生长因子受体家族成员,其异常扩增与表达与乳腺癌的发生、发展密切相关,是乳腺癌的一个重要分子标志物和治疗靶。 Herceptin(主要成分为Trastuzumab)是一种针对HER2/neu蛋白的高纯度重组DNA衍生的人源化单克隆抗体,能够特异性识别HER2/neu蛋白受体的胞外功能区,抑制其介导的信号传导路径,作为针对肿瘤细胞HER2/neu基因靶点的第一个分子靶向药物,为乳腺癌尤其是HER2/neu阳性乳腺癌的临床治疗带来了新的突破。但仍有部分HER2/neu阳性乳腺癌细胞对Herceptin具有耐药性,同时,大剂量的Herceptin对心血管系统也具有一定的毒副作用。因此,临床上多用Herceptin与其它化疗药物联合来治疗HER2/neu阳性乳腺癌。维甲类化合物(retinoids,即维生素A衍生物之统称)通过激活相应的受体调控特定基因的转录活性,从而产生调节细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学效应[1]。天然的全反式视黄酸(ATRA)、13-顺式视黄酸(13-cis RA)、9-顺式视黄酸(9-cis RA)以及合成的TTNPB等已被开发成治疗皮肤癌的药物,广泛应用于临床[2]。在天然的维甲类化合物中,全反式视黄酸和9-顺式视黄酸能激活RAR受体,而只有9-顺式视黄酸可激活RXR受体[3-4],且已有研究发现9-顺式视黄酸的衍生物能够有效抑制HER2/neu转基因小鼠乳腺癌的形成[5],提示作为RXR天然配体的9-顺式视黄酸是一种很有潜力的HER2/neu阳性乳腺癌细胞抑制剂。有鉴于此,本研究以HER2/neu阳性的mda-mb-453细胞和转染了HER2/neu真核表达质粒的MCF-7乳腺癌裸鼠移植瘤为研究对象。利用MTT技术、流式细胞仪技术和TUNEL技术检测了Herceptin和9-顺式视黄酸联合用药对mda-mb-453细胞增殖活性、细胞周期分布以及凋亡的影响,并利用动物实验进一步观察Herceptin和9-顺式视黄酸联合用药对MCF-7细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。另外,利用免疫印记、免疫沉淀以及RT-PCR技术检测mda-mb-453乳腺癌细胞中ErbB2、Cyclin E、p27、CDK2、COX-2、RXRα等分子的表达及其活性,初步探讨了9-顺式视黄酸协同Herceptin抑制乳腺癌的分子机制。主要实验结果和结论如下: 1. MTT,流式细胞仪分析结果显示,与单独用药和对照组相比,Herceptin和9-顺式视黄酸联合用药能够有效协同抑制mda-mb-453细胞的增殖活性,并能将细胞周期进程阻遏于G0/G1期。 2. TUNEL检测结果显示,9-顺式视黄酸和Herceptin联合作用能够有效诱导mda-mb-453乳腺癌细胞发生凋亡,联合处理组的细胞凋亡率显著高于对照组和各单独处理组的细胞凋亡率之合。提示,Herceptin和9-顺式视黄酸能够协同作用有效诱导mda-mb-453乳腺癌细胞发生凋亡从而起到抑制肿瘤的作用。 3.本研究将MCF-7细胞移植到裸鼠体内,成功构建了相应的裸鼠移植瘤模型。经一定剂量的9-顺式视黄酸和Herceptin单独或联合用药后,与对照组相比,联合处理组MCF-7细胞移植瘤的体积和重量明显降低。表明,9-顺式视黄酸和Herceptin能够在体内协同抑制HER2/neu阳性乳腺癌细胞的增殖活性。 4. mda-mb-453细胞经9-顺式视黄酸、Herceptin联合处理24小时后,磷酸化、非磷酸化ErbB2蛋白表达较对照组均显著下降,但Herceptin单独处理组和联合处理组之间的差别并不明显。同时,RXRα表达无显著变化,而COX-2的表达与对照组相比也明显降低。提示Herceptin和9-顺式视黄酸可分别或协同抑制ErbB2以及COX-2的表达和活性从而抑制mda-mb-453乳腺癌细胞的增殖能力。 5. 9-顺式视黄酸、Herceptin联合处理24小时后mda-mb-453细胞CDK2、Cyclin E的表达以及CDK2/Cyclin E激酶复合物的活性较对照组显著下降,而p27蛋白的表达则显著升高,提示9-顺式视黄酸可协同Herceptin通过影响上述G0/G1期相关分子表达和活性来阻遏HER2/neu阳性乳腺癌细胞的周期进程。综上所述,本研究证实联合运用Herceptin和9-顺式视黄酸可通过调控ErbB2、COX-2以及G0/G1期相关分子的表达和活性从而有效协同抑制HER2/neu阳性乳腺癌细胞。

关键词： Herceptin 9-顺式视黄酸 HER2/neu ErbB2 mda-mb-453细胞 MCF-7HER2细胞 MCF-7vector 细胞增殖细胞周期细胞凋亡裸鼠移植瘤 CDK2 Cyclin E COX-2 p27 RXRα

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