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Acta Pharmaceutica Sinica B 2015年第3期5卷 277-284页

作者： Mingbao Lin Wei Sun Wan Gong Yasi Ding Yuanyan Zhuang Qi Hou State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines Institute of Materia MedicaChinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College Clinical Laboratory Center Beijing Friendship HospitalCapital Medical University College of Basic Medical Science Zhejiang Chinese Medical University

Ginsenoside Rg1(GR),a major bioactive compound of traditional Chinese medicine,such as Panax ginseng or Radix Notoginseng,has been shown to exert neuroprotective effects against ischemic stroke.However,pharmacokinetic studies have suggested that GR could not be efficiently transported through the blood–brain barrier.The mechanism by which GR attenuates cerebral ischemic injury in vivo remains largely unknown.Therefore,this study explored potential neuro-protective effects of GR through its systemic metabolic regulating mechanism by using mass spectrometry–based metabolomic profiling.Rats with middle cerebral artery occlusion(MCAO) were treated with GR intravenously.Their metabolic profiles in serum were measured by gas chromatography coupled with mass spectrometry on 1 and 3 days after MCAO.GR exhibited a potent neuro-protective effect by significantly decreasing the neurological scores and infarct volume in the MCAO rats.Moreover,18 differential metabolites were tentatively identified,all of which appeared to correlate well with these disease indices.Our findings suggested that GR carries a therapeutic potential in stroke possibly through a feed-back mechanism by regulating systematic metabolic mediation.

关键词： Ginsenoside Rg1 MCAO Metabolites Biomarkers

亚低温下骨髓间充质干细胞保护大鼠脑缺血损伤的机制研究

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亚低温下骨髓间充质干细胞保护大鼠脑缺血损伤的机制研究

作者：汪嘉伟厦门大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:缺血性脑卒中是导致人类高致死率和致残率的主要疾病之一,至今仍缺乏真正有效的治疗措施。研究表明,通过移植BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cell)可缩小梗死面积,促进神经功能修复。亚低温(32～35℃)治疗可减小梗... 详细信息

研究背景和目的:缺血性脑卒中是导致人类高致死率和致残率的主要疾病之一,至今仍缺乏真正有效的治疗措施。研究表明,通过移植BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cell)可缩小梗死面积,促进神经功能修复。亚低温(32～35℃)治疗可减小梗死灶体积,促进血管再生,减轻脑水肿,促进神经功能恢复。因此,本课题组联合这两种治疗方案以期获得最大治疗效果,为临床上脑血管疾病的治疗提供丰富的理论依据。研究内容和方法:采用密度梯度离心法与全骨髓细胞贴壁法相结合,提取、培养、鉴定以及DAPI标记BMSCs。线栓法制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。MCAO术后立即实施亚低温治疗,持续3小时。MCAO术后24小时侧脑室移植。在MCAO造模前、移植前、移植后1d、5d和10d行改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)。断头取脑,冠状位脑切片行TTC染色,计算梗死面积百分比。免疫荧光染色检测蛋白GFAP(glial fibrillary acidic protein)和 VEGF(vascular endothelial growth factor)的表达及变化趋势。结果:大鼠MCAO术后,神经功能缺失明显,左侧肢体不同程度瘫痪。BMSCs移植联合亚低温治疗显著降低mNSS评分(P<0.01),减小梗死面积(P<0.01),改善脑缺血大鼠预后,优于单方案治疗。免疫荧光染色显示,BMSCs移植联合亚低温治疗,DAPI+GFAP+和DAPI+VEGF+双标阳性细胞数和蛋白GFAP和VEGF荧光强度均有不同程度增加,优于单方案治疗。结论:两种治疗方案的脑保护机制各有侧重但又相互补充,联合治疗能够充分发挥两种治疗方案的优势,进一步减小梗死面积,改善大鼠神经功能,治疗效果优于单方案治疗。

关键词：干细胞亚低温 MCAO

经鼻给药tPA突变体改善小鼠缺血性脑卒中后长期神经损伤的作用及机制研究

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经鼻给药tPA突变体改善小鼠缺血性脑卒中后长期神经损伤的作用及...

作者：张楷苏州大学

学位级别：硕士

第一部分经鼻给药tPA突变体改善小鼠缺血性脑卒中后长期神经损伤的作用目的:研究小鼠缺血性脑损伤(MCAO)模型中,术后给予多剂量tPA突变体观察其对小鼠短期行为学的影响,并选取最优剂量,研究其对小鼠术后长期行为认知功能恢复的作用。方... 详细信息

第一部分经鼻给药tPA突变体改善小鼠缺血性脑卒中后长期神经损伤的作用目的:研究小鼠缺血性脑损伤(MCAO)模型中,术后给予多剂量tPA突变体观察其对小鼠短期行为学的影响,并选取最优剂量,研究其对小鼠术后长期行为认知功能恢复的作用。方法:1.取8-12周龄的C57/BL6雄性小鼠,随机分为5组,分别为四组不同剂量(0.25pg/g,0.5μg/g,1.0μg/g,2.0μg/g)经鼻给药给药组以及PBS经鼻给药对照组,对所有实验小鼠行大脑中动脉栓塞术(MCAO)。术后在各个时间点检测各项行为学,并于14天处死小鼠取出脑组织,检测梗死病灶体积及白质损伤情况。2.取8-12周龄的C57/BL6雄性小鼠,随机分为两组,分别为治疗组以及PBS对照组,对两组小鼠行大脑中动脉栓塞术(MCAO),两组小鼠术后行35天行为学检测各项行为学,检测脑萎缩体积。结果:1.MCAO术后14天短期行为学,给药组行为学表现呈剂量相关性,0.5μg/g的给药组结果明显优于对照组,脑损伤程度降低。2.MCAO术后35天长期行为学,治疗组行为学检测结果明显优于对照组,脑萎缩程度降低。结论:1.tPA突变体对MCAO术后小鼠的脑保护作用呈剂量依赖效应;2.tPA突变体对MCAO术后小鼠的长期运动及认知功能具有显著保护作用.第二部分经鼻给药tPA突变体改善小鼠缺血性脑卒中后长期神经损伤的作用机制目的:通过分析白质的结构性与功能性变化,并利用基因敲除小鼠,研究tPA突变体改善缺血性脑卒中后神经损伤的作用机制。方法:1,取第一部分实验中MCAO术后35天的脑组织,分为治疗组与对照组,进行冰冻切片后染色,染色包括MAP2,SMI32/MBP。2,取8-12周龄的C57/BL6雄性小鼠,随机分为两组,每组6只,分别为治疗组以及PBS对照组进行脑弥散张量检测,对两组小鼠行大脑中动脉栓塞术(MCAO),术后于2天行T2WI扫描,以确保手术的成功,后分别于14天,21天行在体DTI扫描,并于35天后处死小鼠,取出完整脑组织,进行离体DTI扫描。3,取8-12周龄的C57/BL6雄性小鼠,随机分为两组,每组6只,分别为治疗组以及PBS对照组进行电生理测试,对两组小鼠行大脑中动脉栓塞术(MCAO),术后于35天处死小鼠,取出脑组织切片行电生理测试。4,取8-12周龄的C57/BL6雄性小鼠6只,OPC-PPARY基因敲除小鼠6只,同时经鼻给药PBS溶液,对两组小鼠行大脑中动脉栓塞术(MCAO),术后各个时间点检测各项行为学,检测脑萎缩体积。结果:1.MCAO术后35天给药组的SMI32/MBP的荧光度比值在外囊区显著低于对照组。2.MCAO术后2天的T2WI中显示,治疗组与对照组的脑损伤程度未见明显差异,术后晚期21天时,治疗组Fractional Anisotropy(FA)值明显高于对照组。3.MCAO术后35天电生理检测中,治疗组脑片电刺激后反应优于对照组结果。4,MCAO术后35天长期行为学中,基因敲除小鼠表现明显比野生型小鼠差。结论:MCAO术后经鼻给药tPA突变体能明显改善白质损伤情况,有利于保存白质结构性及功能性的完整;通过基因敲除鼠去除内源性tPA的相关受体显著抑制小鼠MCAO后神经功能恢复。

关键词：野生型小鼠 MCAO tPA突变体行为学白质

红波罗花碱A的神经保护作用及其作用机制研究

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红波罗花碱A的神经保护作用及其作用机制研究

作者：谢清江苏大学

学位级别：硕士

红波罗花碱A(Delavatine A)是一种从紫葳科角蒿属植物红波罗花(Incarvillea delavayi)中分离的含有异喹啉并环烷新型骨架的生物碱类化合物。经课题组前期的活性筛选发现,Delavatine A对颅脑创伤造成的星形胶质细胞过度活化具有抑制作用... 详细信息

红波罗花碱A(Delavatine A)是一种从紫葳科角蒿属植物红波罗花(Incarvillea delavayi)中分离的含有异喹啉并环烷新型骨架的生物碱类化合物。经课题组前期的活性筛选发现,Delavatine A对颅脑创伤造成的星形胶质细胞过度活化具有抑制作用,对肿瘤细胞的增值也具有一定的抑制作用。目前尚未有其它活性的报道。缺血性脑卒中是由于脑部血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起的脑组织损伤的急性脑血管疾病,其发病机制复杂,兴奋性神经毒性作用、神经炎症、能量代谢障碍、半暗带去极化及细胞凋亡等都共同参与了缺血性脑卒中的病理变化过程。考虑到Delavatine A在前期筛选中表现出的可能的神经保护作用,我们在本课题中对Delavatine A在谷氨酸诱导的神经细胞损伤、LPS诱导的小胶质细胞活化方面进行了体外神经保护作用研究,并对Delavatine A在大鼠缺血再灌注损伤模型的保护作用进行了研究。1.神经保护作用的细胞筛选。首先在多个细胞水平,采用谷氨酸损伤模型,考察Delavatine A对细胞存活率、LDH释放、细胞形态、细胞凋亡以及凋亡蛋白的影响。分别采用CCK-8法、LDH释放检测法、荧光染色显微镜观察法、流式检测凋亡细胞、Western Blot检测凋亡蛋白的方法,结果表明Delavatine A具有显著的神经保护作用,能有效对抗由兴奋性神经递质谷氨酸引起的细胞损伤与细胞凋亡,具有显著的抗兴奋性神经毒性作用。2.抑制兴奋性神经毒性的初步作用机制研究。从钙离子稳态和抗氧化两个方面考察了细胞内钙离子Ca含量、线粒体膜电位、ROS、GSH和SOD等,结果表明,Delavatine A不仅能有效阻止Ca的内流,维持线粒体膜电位,以平衡细胞内外离子稳态;还能有效减少活性氧ROS的产生,增强还原酶的活力,以对抗氧化应激反应,从两个方面共同发挥抗兴奋性神经毒性作用。3.抑制LPS诱导的小胶质细胞的炎症作用研究。以LPS刺激BV-2神经小胶质细胞为研究对象,考察Delavatine A在细胞水平的抗炎作用。分别采用Griess法、ELISA、RT-PCR检测了化合物对炎症因子NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的调控,并从基因与蛋白表达方面研究了调控炎症因子的分子机制。实验结果显示,Delavatine A主要通过下调iNOS、COX-2蛋白,抑制NF-κB通路p65与IκBα蛋白磷酸化而发挥抗炎作用,而对PI3K/Akt和MAPK信号通路蛋白的表达或磷酸化无调控作用。4.保护大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的作用研究。在评价Delavatine A对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的作用时,以ICR小鼠为实验对象,并通过剂量换算公式用以确定Delavatine A作用于SD大鼠的适宜剂量,后续采用可逆性大脑中动脉闭塞线栓法,以局灶性脑缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)大鼠为研究对象,考察缺血再灌注大鼠的神经功能缺失体征评分和脑梗死体积。实验结果显示,5 mg/kg和10 mg/kg的Delavatine A对脑卒中模型大鼠具有良好的治疗效果。表明Delavatine A在动物体内同样具有良好的神经保护作用。

关键词：红波罗花碱A 兴奋性神经毒性神经炎症神经保护 MCAO 脑卒中

脂氧素A4抑制5-LOX合成对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用

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脂氧素A4抑制5-LOX合成对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用

作者：陈良安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨脂氧素A4(LXA4)在大鼠缺血再灌注脑损伤中的保护作用及5脂氧化酶(5-LOX)途径的作用和机制。方法:SPF级雄性Wistar大鼠随机分成假手术组、大脑中动脉区局灶性脑缺血(MCAO)组、MCAO+LXA4组及MCAO+LXA4+Boc2组。通过Hunter 5分神... 详细信息

目的:探讨脂氧素A4(LXA4)在大鼠缺血再灌注脑损伤中的保护作用及5脂氧化酶(5-LOX)途径的作用和机制。方法:SPF级雄性Wistar大鼠随机分成假手术组、大脑中动脉区局灶性脑缺血(MCAO)组、MCAO+LXA4组及MCAO+LXA4+Boc2组。通过Hunter 5分神经评分评估几组大鼠神经功能缺损,使用干湿法测定脑含水量、通过TTC染色法评估脑梗死体积;Westblot法测定5-LOX、ERK1/2、p-ERK1/2、p38/p-p38、JNK/p-JNK蛋白表达;ELISA法测定5-LOX产物LTB/LTC的表达。结果:MCAO+LXA4组动物的神经功能缺损评分、脑含水量、梗死体积百分比较MCAO组明显改善(PMCAO+LXA4组大鼠脑组织中5-LOX、ERK1/2/p-ERK1/2蛋白表达量及其调控产物LTB/LTC较MCAO组也明显降低(P<0.05),LXA4的抑制作用可被Boc-2部分阻断。结论:脂氧素A4对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用与其对5-LOX及其调控产物的抑制作用相关。

关键词：脂氧素A4 缺血再灌注损伤 5-脂氧化酶 MCAO R

α-倒捻子素衍生物对血管性痴呆大鼠的药效及其机制研究

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α-倒捻子素衍生物对血管性痴呆大鼠的药效及其机制研究

作者：舒仁欢浙江工业大学

学位级别：硕士

背景:血管性痴呆（Vascular Dementia,VD）是仅次于阿尔兹海默病的第二位常见的痴呆,约占痴呆发病人群的15%,它与阿尔兹海默病一样,至今仍没有有效的治疗方法。由于疾病分类和诊断标准的不确定性,对脑血管病理学和认知损伤之间的关系的... 详细信息

背景:血管性痴呆（Vascular Dementia,VD）是仅次于阿尔兹海默病的第二位常见的痴呆,约占痴呆发病人群的15%,它与阿尔兹海默病一样,至今仍没有有效的治疗方法。由于疾病分类和诊断标准的不确定性,对脑血管病理学和认知损伤之间的关系的确切性存在争议,目前临床的方法仅仅是对发病症状的治疗,使用药物延缓VD的发病历程,改善患者的认知。局限性主要在于无法逆转已经存在的神经退行性病变,因此无法做到彻底根治VD。最理想的治疗VD的方法是治疗引起脑血管病变的病因,从而阻止痴呆的进一步恶化。研究已经证实脑部的缺血性损伤引起的炎症反应参与了血管性痴呆的发生与发展,是缺血性痴呆的重要病理特征。α-倒捻子素（α-mangostin）是从藤黄科藤黄属植物山竹果壳中分离所获得,是具有生物活性的氧杂蒽酮类结构的化合物。α-倒捻子素具有与他克林相似的母核结构,α-倒捻子素具有显著抗炎抗氧化的作用,α-倒捻子素具有显著抑制环氧化酶-2（COX-2）的作用,并且对于损伤血管的具有保护和修复作用。课题组在前期发现一种α-倒捻子素衍生物,具有很好的抗炎抗氧化以及促进神经分化的活性。同时,该衍生物优点在于增强活性的同时保持较好的血脑屏障透过率,是治疗脑部退行性病变的潜在候选药物之一。目的:本研究以MCAO线栓法建立大鼠痴呆模型,并采用该α-倒捻子素衍生物进行药物干预。用动物行为学方法评价药效。同时利用蛋白印迹法（western blot）,酶联免疫吸附法（ELISA）探究其治疗作用机制。方法:本研究内容分为三个部分:（1）采用MCAO线栓法致血管性痴呆动物模型,将造模后的大鼠随机分为假手术CON组,VD组,高剂量组（给药20mg/kg）,中剂量组（给药10mg/kg）,低剂量组（给药5mg/kg）和阳性药组（盐酸多奈哌齐lmg/kg）,每组8只。（2）药物治疗结束后,通过Morris水迷宫实验和旷场实验来观察对比各组大鼠的空间学习记忆能力、自主行为与探究行为。运用脑组织形态学观察的手段尼氏染色来比较各组大鼠脑组织的病理变化。（3）酶联免疫吸附法检测IL-1β,IL-6和TNF-α,用以说明α-倒捻子素衍生物对炎症因子的作用;蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑内TRAF6,ikkα,NFκB的蛋白表达情况,予以说明药物作用可能介导的信号通路。初步探究被研究药物的作用机制。结果:（1）与CON相比,VD组的空间认知记忆能力、探究行为明显下降;与VD组相比,各给药组有效地改善了血管性痴呆大鼠空间认知记忆能力和探究行为（P＜.05）。（2）通过尼氏染色显示VD组神经元数目相比CON组大量减少,给药组数量比VD组多。通过ELISA实验发现VD组与CON组相比炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α都明显上升,差异具有统计学意义（P＜0.01）,与VD组相比,各个给药组脑内IL-1β,IL-6,TNF-α的含量下降（P＜0.01）,接近CON组水平。分离提取大鼠大脑细胞膜用WB方法检测TRAF6,得到VD组与CON组相比表达增高,给药组中,高剂量20mg/kg组相比VD组表达显著降低,且具有统计学意义（P＜0.01）。通过WB实验发现VD组与CON组相比IKKα表达增高（P＜0.05）,各给药组大脑内IKKα相比VD组显著降低（P＜0.05）;分离提取细胞核后,通过WB实验得到:NF-κB在核内的表达量,VD组相比CON组有明显升高（P＜0.01）,给药组核内NF-κB表达量比VD组降低（P＜0.01）。结论:（l）α-倒捻子素衍生物可以有效地改善血管性痴呆模型大鼠行为障碍和空间认知障碍。（2）α-倒捻子素衍生物能通过对IKK/NF-κB信号通路的作用,起到抗炎的作用,减轻因再灌注引起的炎症损伤,进而改善和治疗大鼠血管性痴呆。

关键词： α-倒捻子素衍生物血管性痴呆 MCAO 炎症 IKK/NF-κB信号通路

米诺环素对脑缺血大鼠P2X7受体及胶质细胞活化的影响

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米诺环素对脑缺血大鼠P2X7受体及胶质细胞活化的影响

作者：李玮北京中医药大学

学位级别：硕士

近年来,人们发现嘌呤信号分子及其受体在神经发育及其生理功能中,发挥着重要作用,它们通过介导神经元和胶质细胞间的相互作用,参与调控神经发生、神经元迁移和轴突生长等生理过程。同时,在多种神经病变中,如中风、脑外伤、阿尔茨海默病... 详细信息

近年来,人们发现嘌呤信号分子及其受体在神经发育及其生理功能中,发挥着重要作用,它们通过介导神经元和胶质细胞间的相互作用,参与调控神经发生、神经元迁移和轴突生长等生理过程。同时,在多种神经病变中,如中风、脑外伤、阿尔茨海默病、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症、癫痫、神经疼痛中,嘌呤信号分子以及胶质细胞活化发挥着重要作用。米诺环素是一种半合成的第二代四环素衍生物,较其他四环素类药物亲脂性高,能够通过血脑屏障到达中枢神经系统,对多种神经系统疾病模型具有很好的改善作用。但在抗脑缺血实验研究中,关于米诺环素的作用报道不一,本研究观察了米诺华素对大鼠脑缺血急性期嘌呤受体P2X7以及胶质细胞活化的影响,并初步探讨了药物的作用机制。1米诺环素对脑缺血大鼠神经元损伤的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠神经元损伤的影响。方法:采用大鼠中动脉栓塞（MCAO）再灌注模型,用免疫组织化学法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对大鼠缺血侧脑组织中NeuN表达的影响。结果:在大鼠缺血侧皮层及纹状体区域,各组神经元细胞核呈NeuN阳性表达;两个区域内的NeuN细胞数组间无统计学差异,但NeuN表达量组间有差异。米诺环素22.5 mg/kg、45mg/kg组与MCAO损伤组相比,皮层及纹状体区域NeuN表达量均显著降低（P＜0.05）。同时,各组NeuN在神经元的细胞核上分布存在一定差异,其中,假手术组神经元NeuN在细胞核呈圆形或卵圆形分布,MCAO损伤组神经元NeuN呈梭形分布,通过综合观察DAPI细胞核染色结果,初步判断这是细胞核的一种固缩现象。米诺环素22.5 mg/kg、45mg/kg组神经元NeuN呈更小的梭形或三角形分布。纹状体区域的神经元细胞核以及NeuN表达与皮层有类似现象,其中,米诺环素组细胞核固缩更加明显。结论:在脑缺血后24小时,米诺环素能进一步加重脑缺血后神经元损伤。2米诺环素对脑缺血大鼠nNOS的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠nNOS的影响。方法:采用Western Blot法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对脑缺血大鼠缺血侧脑组织中nNOS的影响。结果:MCAO损伤组与假手术组相比,nNOS含量明显降低（P＜0.05）,下降率高达84%;给予米诺环素22.5mg/kg、45mg/kg后,分别使nNOS含量升高109%（P＞0.05,与MCAO损伤组相比）、233%（P＜0.05,与MCAO损伤组相比）。结论:诺环素可以使脑缺血后脑组织nNOS表达增加。3米诺环素对脑缺血大鼠小胶质细胞激活的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠小胶质细胞激活的影响。方法:采用免疫组织化学法及小胶质细胞特异性标记物Iba1,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对脑缺血大鼠缺血侧脑组织中Iba1表达的影响。结果:各组大鼠脑组织缺血侧皮层及纹状体的Iba1细胞数无显著差异。但是,MCAO损伤组与假手术组相比,大鼠脑组织缺血侧皮层及纹状体的Iba1表达量明显增多（P＜0.05）,各区域分别增加78.97%、89.62%;米诺环素给药组与MCAO损伤组相比,无明显差异。此外,小胶质细胞的形态也存在一定差异,具体表现为:假手术组的小胶质细胞突起呈放射状,均匀朝向各个方向;MCAO损伤组与假手术组相比,突起长度变长,数目增多,细胞体积变大;米诺环素给药组与MCAO损伤组相比,细胞形态相似。结论:米诺环素对脑缺血再灌注后小胶质细胞激活没有抑制作用。4米诺环素对脑缺血大鼠IL-1β、TNF-α的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠IL-1 β、TNF-α的影响。方法:采用酶联免疫法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对脑缺血大鼠缺血侧脑组织中IL-1β、TNF-α的影响。结果:MCAO损伤组与假手术组相比,IL-1β和TNF-α含量均无明显差异;米诺环素22.5mg/kg组与MCAO损伤组相比,IL-1β和TNF-α含量分别升高45%、40%,且均有统计学差异（P＜0.05）。结论:在该观测时间点,IL-1β和TNF-α还未大量释放到细胞间隙;而米诺环素具有促进二者释放的作用。5米诺环素对脑缺血大鼠P2X7受体的影响目的:米诺环素对脑缺血大鼠P2X7受体的影响。方法:采用免疫组织化学法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对缺血侧皮层及纹状体P2X7受体表达的影响。结果:P2X7广泛分布在大鼠大脑皮层及纹状体区域的神经元和小胶质细胞上。在大鼠缺血侧各区域内,各组P2X7阳性细胞数无明显差异,但在纹状体区域,米诺环素22.5mg/kg、45mg/kg组P2X7阳性细胞数与MCAO损伤组相比,分别减少54.93%、24.00%。此外,P2X7/NeuN和P2X7/Iba1免疫组化结果显示,在大鼠缺血侧皮层及纹状体区域,各组P2X7/NeuN和P2X7/Iba1双标的阳性细胞数无显著差异（P＞0.05

关键词： IL-1β MCAO 米诺环素 nNOS P2X7 受体 TNF-α

白藜芦醇在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制的研究

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白藜芦醇在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制的研究

作者：罗红江苏大学

学位级别：硕士

脑卒中是全球致死的第二大因素,是神经系统最严重和最致命的疾病,严重影响着患者的生活质量,并给家庭和社会带来巨大的经济负担。脑卒中”(cerebral stroke)又称“中风”或“脑血管意外”(cerebralvascular accident,CVA),是一种急性脑... 详细信息

脑卒中是全球致死的第二大因素,是神经系统最严重和最致命的疾病,严重影响着患者的生活质量,并给家庭和社会带来巨大的经济负担。脑卒中”(cerebral stroke)又称“中风”或“脑血管意外”(cerebralvascular accident,CVA),是一种急性脑血管疾病,常见于脑基底动脉突然破裂或局部血管栓塞导致大脑局部供血急剧降低而引起的一组临床综合征,包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的发病率最高,占脑卒中总数的60%0%,主要由大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)引起[1],发病年龄多在40岁以上,男性居多。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)作为一种对称性二苯基乙烯化合物,其在哺乳类动物中具有显著的药理学作用。RSV可通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖和促进其凋亡;此外,RSV具有一定的抗氧化作用,并通过调节乙酰胆碱酯酶改善埃尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)小鼠的认知能力[2]。Fukao等研究发现RSV预处理有降低大鼠心肌缺血再灌注损伤、扩张其冠状动脉和抗动脉粥样硬化的作用[3];Lanzillotta等研究发现RSV预处理降低氧糖剥夺(oxygen and glucosedeprivation,OGD)诱导的小鼠原代皮层神经元凋亡[4];最近研究表明,RSV促进血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)表达可降低小鼠心肌缺血再灌注损伤,又有研究表明VEGF-B在脑组织中广泛表达[5];而RSV是否通过调控VEGF-B表达参与大鼠脑缺血再灌注诱发内源性神经保护作用尚不十分清楚。目的探究白藜芦醇在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制,以及脑血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)表达变化对白藜芦醇的神经作用的影响。方法(1)清洁级健康成年雄性SD大鼠若干,体重260-270 g。按照随机数字表法随机分为5组(n=6):对照组(C组),短暂性大脑中动脉阻塞再灌注组(I/R组),低剂量白藜芦醇预处理组(RSV组),中剂量白藜芦醇预处理组(RSV组)和高剂量白藜芦醇预处理组(RSV组)。C组同I/R组但不栓塞大脑中动脉;I/R组短暂性MCAO 2 h后再灌注;RSV组、RSV组和RSV组在MCAO前1周每天分别经腹腔注射25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的RSV,然后行MCAO 2 h后再灌注。在再灌注6 h时断头取脑,提取缺血半暗带脑组织,用western blot检测促凋亡因子cleaved caspase-3和抗凋亡因子Bcl-2的表达;在再灌注12 h时断头取脑,提取缺血半暗带脑组织,用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)检测炎症因子TNF-α和IL-1β;在再灌注24 h和72 h采用标准的神经功能缺陷评分量表评价大鼠MCAO后神经功能;然后断头取脑,用2%TTC染色,然后使用Image J软件进行图像分析,计算脑梗死体积的大小,并采用校正公式降低缺血后脑水肿对实验结果的影响。(2)清洁级健康成年雄性SD大鼠若干,体重260-270 g。按照随机数字表法随机分为6组(n=6):对照组(C组),大脑中动脉阻塞再灌注组(I/R组),载体组(Vehicle,V组),VEGF-B-siRNA阴性对照组(siRNA-c组),VEGF-B-siRNA组(siRNA组)和RSV+VEGF-B-siRNA组(R-V组)。C组同I/R组,但不栓塞大脑中动脉;I/R组行MCAO 2 h后再灌注;V组、siRNA-c组和siRNA组在MCAO前24 h、48 h和72 h时分别经大鼠侧脑室注射8μL转染试剂(Vehicle)jetPEI、8μL(4μg)VEGF-B-siRNA-c、8μL(4μg)VEGF-B-siRNA;R-V组在MCAO前1周每天经腹腔注射100 mg/kg的RSV,然后在MCAO前24 h、48 h和72 h时经大鼠侧脑室注射8μL(4μg)VEGF-B-siRNA。在再灌注6 h时断头取脑,用2%TTC染色,提取缺血半暗带脑组织,用western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2、Phospho-CREB(p-CREB)和Phospho-Akt(p-Akt)的表达变化;在再灌注12 h时断头取脑,用2%TTC染色,提取缺血半暗带脑组织,用RT-PCR检测TNF-α和IL-1β的表达变化;分别在再灌注24 h和72 h时用标准的神经功能缺陷评分量表评估大鼠MCAO后神经功能,接着断头取脑,用2%TTC染色,然后使用Image J软件进行图像分析,计算脑梗死体积的大小,并采

关键词：白藜芦醇 VEGF-B siRNA 侧脑室注射大鼠脑缺血再灌注损伤 MCAO TTC 缺血半暗带

基于ERK1/2通路探讨高压氧对MCAO大鼠大脑皮质损伤的作用及其机制

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基于ERK1/2通路探讨高压氧对MCAO大鼠大脑皮质损伤的作用及其机制

作者：陆玉熊吉林大学

学位级别：硕士

目的：脑缺血后的梗死边缘区组织供血供氧低下、能量缺失而将导致其中的神经元死亡，为增强边缘区组织的血氧供应，人们试图使用高压氧（Hyperbaricoxygen，HBO）作为一种供氧方案，然而其疗效却存在一定风险，尚有一定争论，并且其具... 详细信息

目的：脑缺血后的梗死边缘区组织供血供氧低下、能量缺失而将导致其中的神经元死亡，为增强边缘区组织的血氧供应，人们试图使用高压氧（Hyperbaricoxygen，HBO）作为一种供氧方案，然而其疗效却存在一定风险，尚有一定争论，并且其具体作用机制还不清楚。本研究通过观察高压氧对大脑中动脉梗阻/再灌注（MCAO/R）大鼠模型的作用，检测大脑皮质梗死边缘区的自噬发生情况，通过分析组织的氧化应激与MAPK信号通路的活化对自噬的调节作用和Mcl-1的表达，探讨高压氧对脑缺血损伤的作用机制。方法：将Wistaar大鼠随机分为假手术组（sham），MCAO模型对照组（MCAO）和高压氧治疗组（HBO）。采用线栓法制作脑缺血模型，造成1.5h缺血后拔出栓线进行再灌注，并经Longa评分达3分者进入实验。HBO组于再灌注3h时给予绝对大气压（ATA）为3.0的纯氧高压并维持1h（不包含之前的10min升压和之后的20min降压），HBO与MCAO组于再灌注24h时处死。大鼠大脑组织冠状切片经红四氮唑（TTC）染色和苏木精-伊红（H&E）染色法分别用于测量大脑梗死面积比和大脑受损情况;取大鼠大脑皮质梗死边缘区（marginal zone）组织，分别使用RT-PCR，Western blotting检测其中自噬相关蛋白LC3，Beclin-1，p62的表达情况;检测MAPK成员中的胞外调节激酶（ERK1/2）的表达与活化情况和抗氧化组分（HO1，NQO1，GLSM）的表达;并测得凋亡调节蛋白Bax，Mcl-1的变化情况。结果：TTC染色可见MCAO组脑组织出现明显的梗死灶，且HBO组梗死面积比高于MCAO组（p＜0.01），组织石蜡切片经H&E染色观察到HBO组神经元胞体固缩较多且组织较疏松，表明HBO加重了MCAO大鼠脑损伤。 HBO组LC3的转化、p62含量均高于MCAO组（p＜0.01），且两组脑组织的自噬起始蛋白Beclin1在mRNA水平表达不存在差异的情况下而蛋白含量均有明显下降，提示两组Beclin1均被利用，自噬被激活，且HBO组中自噬通路可能受阻。实验中我们检测到HBO组MAPK通路的下游蛋白ERK1/2的活化强于MCAO组，并且抗氧化酶（HO1，NQO1，GLSM）在HBO组中的表达强于MCAO组，表明ERK1/2可能是受到较强的氧化应激而被持续活化。而加入ERK1/2特异性抑制剂U0126不仅可使MCAO组与HBO组梗死面积明显下降，且使HBO组LC3与p62的含量明显降低，表明MAPK通路下游蛋白ERK1/2的活化通过使自噬通路受阻而使HBO加重MCAO损伤。抗凋亡蛋白Mcl-1的mRNA表达水平在HBO组较MCAO组显著升高，且MCAO组显著高于sham组（p＜0.01），然而在蛋白水平却组均显著低于sham组（p＜0.01），且HBO组与MCAO组的脑组织Mcl-1蛋白表达差异无统计学意义，表明在HBO组Mcl-1的降解量较MCAO组多。同时HBO组Bax/Mcl-1值明显高于MCAO组（p＜0.01）提示HBO可能促进凋亡的发生。结论：高压氧可造成脑缺血组织损伤加剧;高压氧一方面可能通过氧化作用诱导ERK1/2持续活化而导致自噬通路受阻，促进脑缺血组织神经元死亡;另一方面通过促进神经元内Mcl-1的降解造成组织中抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的失衡而促进神经元凋亡。本研究提示在运用高压氧改善脑缺血供氧状况时，联合应用ERK1/2抑制剂可降低高压氧治疗存在的潜在风险。

关键词：脑缺血高压氧自噬凋亡 MCAO ERK1/2 Mcl-1

丁香酚经嗅觉通路改善MCAO大鼠缺血神经功能的机制研究

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丁香酚经嗅觉通路改善MCAO大鼠缺血神经功能的机制研究

作者：胡泓博安徽医科大学

学位级别：硕士

研究背景及目的:脑缺血疾病在临床上主要治疗手段是长期口服抗凝药物或者扩血管药物。其损伤机制主要是氧化损伤、免疫炎症介质释放、神经营养因子的缺失与释放等。针对神经细胞的保护作用,在以往的研究中我们发现芳香小分子物质可以通... 详细信息

研究背景及目的:脑缺血疾病在临床上主要治疗手段是长期口服抗凝药物或者扩血管药物。其损伤机制主要是氧化损伤、免疫炎症介质释放、神经营养因子的缺失与释放等。针对神经细胞的保护作用,在以往的研究中我们发现芳香小分子物质可以通过嗅觉通路与相应的神经元受体结合,调节相应的神经元细胞。芳香物质经嗅觉通路的给药方式对于脑缺血疾病可能是一种新的防治手段。人类嗅觉与脑功能之间联系密切,嗅觉在一定程度上影响生命本能、学习记忆能力、情绪调节等。嗅觉还与人类的生命活动和生活质量密切相关,嗅觉功能障碍一般会发生在一些重大疾病的初期。嗅觉对大脑皮质、海马、杏仁核、下丘脑、纹状体、梨状皮层、内嗅皮质等脑区神经肽都有调节作用。那么嗅觉通路对脑缺疾病后损伤是否有影响呢?作为嗅觉吸嗅的给药方式相对于口服和注射给药方便安全,高特异性,高敏感度,芳香分子经嗅觉通路给药对于脑缺血疾病能否起到干预作用?其作用机制又是什么?本实验通过大鼠MCAO模型探讨挥发性芳香物质丁香酚,通过嗅觉通路给药方式对于脑缺血后损伤的保护作用及其机制。第一部分MCAO大鼠的模型制备及神经功能评分方法采用大脑中动脉内线栓阻断法制造大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h后再灌注24h,参照Longa评分标准对大鼠进行神经功能评分,将评分为1分的用做实验用鼠,随机分组为丁香酚组和模型组,行假手术成功的大鼠归类为假手术组。共分四组:丁香酚组、模型组、假手术组和正常组。结果神经功能评分1分归为模型组和丁香酚组,大鼠有明显的转圈、倾倒、前肢无法伸展的表现。假手术组和正常组神经功能评分为0,无任何异常表现。第二部分丁香酚经嗅觉通路干预MCAO大鼠及神经行为学观察方法丁香酚组给予吸嗅丁香酚3w后,其余组别不作处理正常饲养,各组再次进行神经功能评分后取部分处死,脑切片行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,计算脑梗死容积百分比;通过Morris水迷宫实验检测大鼠脑缺血干预后的学习记忆能力和空间探索能力。结果神经功能评分中丁香酚组与模型组比较,差异有显著性意义(PMCAO模型大鼠的缺血后损伤,其

关键词：丁香酚嗅觉通路 MCAO 脑源性神经营养因子 5-HT 反向虚拟筛选