白藜芦醇在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制的研究

作     者：罗红 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵东华

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：白藜芦醇 VEGF-B siRNA 侧脑室注射 大鼠脑缺血再灌注损伤 MCAO TTC 缺血半暗带 

摘      要：脑卒中是全球致死的第二大因素,是神经系统最严重和最致命的疾病,严重影响着患者的生活质量,并给家庭和社会带来巨大的经济负担。脑卒中(cerebral stroke)又称“中风或“脑血管意外(cerebralvascular accident,CVA),是一种急性脑血管疾病,常见于脑基底动脉突然破裂或局部血管栓塞导致大脑局部供血急剧降低而引起的一组临床综合征,包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的发病率最高,占脑卒中总数的60%0%,主要由大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)引起[1],发病年龄多在40岁以上,男性居多。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)作为一种对称性二苯基乙烯化合物,其在哺乳类动物中具有显著的药理学作用。RSV可通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖和促进其凋亡;此外,RSV具有一定的抗氧化作用,并通过调节乙酰胆碱酯酶改善埃尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)小鼠的认知能力[2]。Fukao等研究发现RSV预处理有降低大鼠心肌缺血再灌注损伤、扩张其冠状动脉和抗动脉粥样硬化的作用[3];Lanzillotta等研究发现RSV预处理降低氧糖剥夺(oxygen and glucosedeprivation,OGD)诱导的小鼠原代皮层神经元凋亡[4];最近研究表明,RSV促进血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)表达可降低小鼠心肌缺血再灌注损伤,又有研究表明VEGF-B在脑组织中广泛表达[5];而RSV是否通过调控VEGF-B表达参与大鼠脑缺血再灌注诱发内源性神经保护作用尚不十分清楚。目的探究白藜芦醇在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制,以及脑血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)表达变化对白藜芦醇的神经作用的影响。方法(1)清洁级健康成年雄性SD大鼠若干,体重260-270 g。按照随机数字表法随机分为5组(n=6):对照组(C组),短暂性大脑中动脉阻塞再灌注组(I/R组),低剂量白藜芦醇预处理组(RSV组),中剂量白藜芦醇预处理组(RSV组)和高剂量白藜芦醇预处理组(RSV组)。C组同I/R组但不栓塞大脑中动脉;I/R组短暂性MCAO 2 h后再灌注;RSV组、RSV组和RSV组在MCAO前1周每天分别经腹腔注射25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的RSV,然后行MCAO 2 h后再灌注。在再灌注6 h时断头取脑,提取缺血半暗带脑组织,用western blot检测促凋亡因子cleaved caspase-3和抗凋亡因子Bcl-2的表达;在再灌注12 h时断头取脑,提取缺血半暗带脑组织,用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)检测炎症因子TNF-α和IL-1β;在再灌注24 h和72 h采用标准的神经功能缺陷评分量表评价大鼠MCAO后神经功能;然后断头取脑,用2%TTC染色,然后使用Image J软件进行图像分析,计算脑梗死体积的大小,并采用校正公式降低缺血后脑水肿对实验结果的影响。(2)清洁级健康成年雄性SD大鼠若干,体重260-270 g。按照随机数字表法随机分为6组(n=6):对照组(C组),大脑中动脉阻塞再灌注组(I/R组),载体组(Vehicle,V组),VEGF-B-siRNA阴性对照组(siRNA-c组),VEGF-B-siRNA组(siRNA组)和RSV+VEGF-B-siRNA组(R-V组)。C组同I/R组,但不栓塞大脑中动脉;I/R组行MCAO 2 h后再灌注;V组、siRNA-c组和siRNA组在MCAO前24 h、48 h和72 h时分别经大鼠侧脑室注射8μL转染试剂(Vehicle)jetPEI、8μL(4μg)VEGF-B-siRNA-c、8μL(4μg)VEGF-B-siRNA;R-V组在MCAO前1周每天经腹腔注射100 mg/kg的RSV,然后在MCAO前24 h、48 h和72 h时经大鼠侧脑室注射8μL(4μg)VEGF-B-siRNA。在再灌注6 h时断头取脑,用2%TTC染色,提取缺血半暗带脑组织,用western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2、Phospho-CREB(p-CREB)和Phospho-Akt(p-Akt)的表达变化;在再灌注12 h时断头取脑,用2%TTC染色,提取缺血半暗带脑组织,用RT-PCR检测TNF-α和IL-1β的表达变化;分别在再灌注24 h和72 h时用标准的神经功能缺陷评分量表评估大鼠MCAO后神经功能,接着断头取脑,用2%TTC染色,然后使用Image J软件进行图像分析,计算脑梗死体积的大小,并采用校正公式降低缺血后脑水肿对实验结果的影响。结果(1)与C组比较,I/R组、RSV组、RSV组和RSV组cleaved caspase-3、TNF-α和IL-1β表达升高,Bcl-2表达降低,脑梗体积增加,神经功能缺陷评分降低;与I/R组比较,RSV组cleaved caspase-3、TNF-α和IL-1β表达降低,72h时神经功能缺陷评分升高;与I/R组比较,RSV组cleaved caspase-3、TNF-α和IL-1β表达降低,Bcl-2表达升高,脑梗体积减少,神经功能缺陷评分升高;与RSV组比较,RSV组cleaved caspase-3、TNF-α和IL-1β表达降低,Bcl-2表达升高,脑梗体积减少,神经功能缺陷评分升高。(2)与C组比较,I/R组、V组、siRNA-c组、siRNA组和R-V组cleaved caspase-3、TNF-α、IL-1β、p-Akt和p-CREB表达升高,Bcl-2表达降低,24 h和72 h时脑梗体积增加,24 h和72 h时神经功能缺陷评分降低;与siRNA-c组比较,siRNA组和R-V组cleaved caspase-3、TNF-α和IL-1β表达升高,Bcl-2、p-Akt和p-CREB表达降低,脑梗体积增加,神经功能缺陷评分降低;siRNA组和R-V组间cleaved caspase-3、TNF-α、IL-1β、Bcl-2、p-CREB和p-Akt表达差异无统计学意义,脑梗体积和神经功能缺陷评分差异无统计学意义;I/R组、V组和siRNA-c组间cleaved caspase-3、TNF-α、IL-1β和Bcl-2表达差异无统计学意义,脑梗体积和神经功能缺陷评分差异无统计学意义。结论(1)白藜芦醇预处理降低大鼠脑缺血再灌注损伤,而抑制VEGF-B表达降低白藜芦醇的神经保护作用;(2)Akt信号通路参与调控白藜芦醇的神经保护作用;(3)白藜芦醇可能通过促进VEGF-B表达拮抗大鼠脑缺血再灌注损伤,其机制可能与Akt信号通路有关。