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国际眼科杂志 2022年第9期22卷 1485-1489页

作者：刘莎蒋沁南京医科大学附属眼科医院江苏省南京市210029

müller胶质细胞(müller glial cells,mGCs)是视网膜中的主要神经胶质细胞,呈放射状横跨整个视网膜。mGCs与视网膜神经元紧密接触,相互作用,参与维持视网膜内稳态。在视网膜神经损伤后,mGCs启动多种调控途径应答视网膜内环境改变和损伤... 详细信息

müller胶质细胞(müller glial cells,mGCs)是视网膜中的主要神经胶质细胞,呈放射状横跨整个视网膜。mGCs与视网膜神经元紧密接触,相互作用,参与维持视网膜内稳态。在视网膜神经损伤后,mGCs启动多种调控途径应答视网膜内环境改变和损伤,产生视网膜神经保护作用,如:调节神经递质释放,释放神经保护因子及抗氧化因子,重编程进行内源性修复。但在视网膜持续损伤状态下,mGCs增生也能加重神经元功能障碍和丢失。因此,正确认识mGCs对病理刺激的反应及其产生的保护和损害作用,对于研究视网膜神经损伤性疾病的机制及指导疾病治疗具有重要意义。本文围绕mGCs在视网膜神经损伤及修复过程中的作用展开综述,旨在为视网膜神经保护提供新的策略。

关键词： müller胶质细胞视网膜神经损伤神经保护

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自噬对müller胶质细胞线粒体功能和凋亡的调控及机制研究

自噬对Müller胶质细胞线粒体功能和凋亡的调控及机制研究

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作者：秦梦琪南昌大学

学位级别：硕士

视网膜退行性病变是指视网膜细胞的不可逆性损伤。müller胶质细胞（müller glia cell,mGC）是视网膜中最主要的胶质细胞,对视网膜内其他细胞成分起着支持保护的作用,已有证据表明,在一些退行性病变的视网膜中可以发现功能失常的mülle... 详细信息

视网膜退行性病变是指视网膜细胞的不可逆性损伤。müller胶质细胞（müller glia cell,mGC）是视网膜中最主要的胶质细胞,对视网膜内其他细胞成分起着支持保护的作用,已有证据表明,在一些退行性病变的视网膜中可以发现功能失常的müller胶质细胞。自噬在细胞内分解生物大分子的分子机制且被发现参与了视网膜退行性病变的发病过程。但是目前对于自噬是否且如何影响müller胶质细胞功能尚不清楚。目的:明确自噬在正常培养以及氧化应激下对müller胶质细胞线粒体形态,活性氧的产生,线粒体膜电位以及凋亡的影响,并探究去沉默信息调节蛋白4（Silent information regulator protein 4,SIRT4）影响müller胶质细胞自噬功能的相关分子机制。为日后治疗青光眼等视网膜退行性病变提供潜在的分子靶点。方法:本研究首先以鼠来源müller胶质细胞（r-mC）为对象,设置6个组别对r-mC进行分组培养:正常对照组,雷帕霉素（rapamycin,RAPA）处理组,3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-mA）处理组,氧化应激组,氧化应激加雷帕霉素处理组,氧化应激加3-mA组。通过免疫蛋白印记定量检测cleaved-caspase3的表达和活死细胞染色来评估细胞凋亡情况。通过转染线粒体特异性定位质粒（mito-Ds Red）检测线粒体形态变化,通过免疫蛋白印记定量检测视力萎缩基因1（Optic atrophy gene1,OPA1）,动力相关蛋白1（Dynamin-related protein1,DRP1）的表达变化,评估线粒体分离融合的情况。活性氧（Reactive oxygen species,ROS）试剂盒检测ROS产生变化,流式检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,mmP）变化。通过转染SIRT4 RNAi（Ribonucleic acid interference）病毒,在r-mC中敲低SIRT4的表达,建立稳定SIRT4低表达细胞系。通过免疫蛋白印记定量检测微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain-3B,LC3）,P62,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）,腺苷5’-单磷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AmPK）蛋白表达和磷酸化水平的变化,探究自噬功能以及AmPK及下游信号通路的激活情况。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）试剂盒检测r-mC正常对照组,SIRT4表达敲低组的ATP产生情况。最后应用药物Compound C分别处理r-mC正常对照组与SIRT4敲低组,抑制p-AmPK磷酸化,探究自噬相关蛋白的表达情况。结果:正常培养条件下,3-mA诱导的自噬功能下调不会引起r-mC的形态学改变以及明显凋亡。氧化应激条件下,与单纯氧化应激组相比,3-mA处理后可引起r-mC细胞肥大,形成聚集团块,且凋亡增加。在氧化应激条件下,3-mA诱导的自噬下调可以降低氧化应激下OPA1的表达水平,而雷帕霉素诱导的自噬上调可以减少DRP1的表达水平。同样,在氧化应激情况下,与单纯氧化应激组相比,3-mA介导的自噬下调还可以引起ROS的产生增加和mmP去极化增加。免疫蛋白印记定量检测结果显示,与r-mC正常对照组相比,r-mC细胞的SIRT4基因表达敲低后,AmPK的磷酸化水平增加,m TOR的磷酸化水平下降,LC3 I/II比值升高,P62表达水平下降,ATP的产生减少。最后分别在r-mC正常对照组与SIRT4敲低组中加入AmPK磷酸化抑制剂Compound C处理后发现,与SIRT4敲低组相比,Compound C可逆转SIRT4敲低引起的LC3 I/II比值上调和P62的表达减少。结论:r-mC对于自噬功能紊乱引起的损伤反应性与氧压有关。正常培养条件下,自噬功能紊乱不会对r-mC线粒体功能与凋亡造成影响。但是氧化应激条件下,自噬功能的下调可以引起r-mC的胶质增生并呈团块状聚集,线粒体融合减少,呈点状结构,ROS产生增加,mmP明显去极化并加剧r-mC的凋亡。最后,我们的结果表明在r-mC中SIRT4敲低可以通过减少ATP的生成,抑制AmPK-m TOR信号通路,激活r-mC的自噬功能。

关键词：视网膜退行性病变 müller胶质细胞自噬凋亡 SIRT4

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跨膜蛋白Ttyh1在视网膜细胞形成及损伤修复中的作用研究

跨膜蛋白Ttyh1在视网膜细胞形成及损伤修复中的作用研究

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作者：梁雅楠延安大学

学位级别：硕士

哺乳类动物视网膜由间脑的神经上皮向两侧突起形成视泡发育而来,是中枢神经系统的一部分。在发育过程中,视网膜前体细胞（Retinal progenitor cells,RPCs）依次分化出视网膜中的7种主要神经细胞类型:神经节细胞及水平细胞最先产生,其次... 详细信息

哺乳类动物视网膜由间脑的神经上皮向两侧突起形成视泡发育而来,是中枢神经系统的一部分。在发育过程中,视网膜前体细胞（Retinal progenitor cells,RPCs）依次分化出视网膜中的7种主要神经细胞类型:神经节细胞及水平细胞最先产生,其次是视锥细胞和无长突细胞,最后是视杆细胞、双极细胞和müller氏胶质细胞,主要在出生后分化完成。7型细胞经过迁移后规则排列并建立突触联系,最终形成视网膜的三个核层（nuclear layers）及将它们联系起来的两个突触层（synaptic layers）,从而完成光信号的接收、转换和传导。视网膜丰富的细胞类型和规则的层次结构,是视觉功能实现的生物学基础。作为视网膜前体细胞产生的唯一一型胶质细胞,müller胶质细胞在正常生理条件下发挥营养因子释放、细胞碎片吞噬、维持视网膜代谢与稳态等多种功能;在病理条件下则具有损伤反应能力,在损伤视网膜的信号传递和损伤修复过程中具有重要意义。尽管已揭示出调控视网膜发育及视网膜损伤后修复的多种细胞因子与信号通路,但仍有许多功能未知的视网膜特异表达基因可能在其中发挥作用。既往研究发现,跨膜蛋白Ttyh1在发育期视网膜中表达,并随着视网膜müller胶质细胞的分化表现出显著而短暂的上调。跨膜蛋白Ttyh1在神经系统中对于神经干细胞干性维持、抑制静息/激活转换以及神经发生的作用已有明确阐述,但其在不同时期视网膜中的表达、功能以及对视网膜损伤修复的作用还未有深入研究。由此,本研究借助生物信息学分析及多种染色技术,揭示跨膜蛋白Ttyh1在视网膜中的表达模式;接着采用自主构建的Ttyh1敲除小鼠,探究其对视网膜各型细胞形成的影响;最后在Ttyh1敲除小鼠上建立视网膜兴奋性毒性损伤模型,明确其对müller胶质细胞应对视网膜损伤反应的调控作用。主要研究内容及研究结果如下:1、跨膜蛋白Ttyh1在发育期小鼠和成年小鼠视网膜中均有表达,在发育期视网膜中的表达主要集中于视网膜前体细胞和müller胶质细胞。对胚胎14.5天的（embryonic day 14.5,E14.5）野生型胎鼠和出生后当天的（postnatal day 0,P0）野生型仔鼠视网膜组织的冰冻切片进行原位杂交染色,揭示Ttyh1在小鼠视网膜发育中表达,且表达集中于RPCs所在区域;对出生后4天（P4）和3个月（3 months,3m）野生型小鼠视网膜组织的冰冻切片进行免疫组织荧光染色,证实出生后早期和成体期小鼠视网膜的内核层均有跨膜蛋白Ttyh1的表达;利用GEO数据库现有的单细胞RNA测序数据,分析从E11到P14的视网膜发育期Ttyh1的表达谱。在E11-E18的视网膜胚胎发育期间,Ttyh1的表达主要集中于RPCs中;出生后自P2天起,Ttyh1的表达出现在müller胶质细胞中;在P2到P5期间,随着müller胶质细胞的分化,Ttyh1在müller胶质细胞中的表达表现为短暂而剧烈的升高,后随发育进程的结束而下降。2、Ttyh1敲除导致成年小鼠（3m）müller胶质细胞数目显著增加,并持续至小鼠中老年期（10m）。在课题组前期自主构建的Ttyh1基因敲除小鼠上,通过不同生长阶段小鼠视网膜切片的H&E染色和细胞核荧光衬染,揭示Ttyh1敲除后小鼠视网膜的层次结构无显著变化;进而通过对不同年龄小鼠视网膜组成的7型细胞分别进行免疫荧光染色,发现与对照组小鼠相比,Ttyh1敲除后3m小鼠的müller胶质细胞显著增多,其余感光细胞、神经节细胞和中间神经元数目未见显著差异。为判别这种变化是否为一过性的,我们进而分析了10m对照与敲除小鼠视网膜7型细胞,在10m敲除小鼠中观察到müller胶质细胞具有更长的规律排列的神经突起延伸;随后利用GFAP抗体标记müller胶质细胞终足,并使用SOX9抗体标记müller胶质细胞细胞核,再次进行免疫荧光染色及数据统计,证实与对照组相比,Ttyh1敲除后3m及10m小鼠的视网膜müller胶质细胞均显著增多。3、Ttyh1敲除促进出生后早期视网膜前体细胞的增殖,并增强了müller胶质细胞的分化过程。为了进一步确认上述müller胶质细胞增多是否因分化增多所致,我们将表型分析追溯至发育期。通过对P4小鼠视网膜的Brd U掺入及染色以及Ki67增殖细胞免疫荧光染色,发现相比于对照组,Ttyh1敲除小鼠视网膜的Ki67细胞显著增多;随后利用SOX9抗体对P4小鼠视网膜进行müller胶质细胞的免疫荧光染色。发现与对照组相比,Ttyh1敲除小鼠视网膜中停留在顶尖侧（Apical side）待迁移的müller胶质细胞和已迁移至神经母细胞层内侧的müller胶质细胞数目相当,而迁移中的müller胶质细胞数目增多,表明Ttyh1的敲除促进了出生后早期RP

关键词：跨膜蛋白Ttyh1 视网膜 müller胶质细胞视网膜损伤修复

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白藜芦醇调节视网膜缺血/再灌注损伤的细胞焦亡机制研究

白藜芦醇调节视网膜缺血/再灌注损伤的细胞焦亡机制研究

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作者：谢志南昌大学

学位级别：硕士

视网膜缺血/再灌注(I/R)是青光眼发病时重要的病理生理特征,将导致视网膜炎症和神经节细胞(RGCs)的死亡,目前仍缺乏有效靶点挽救RGCs。细胞焦亡是一种促炎性细胞程序性死亡形式,可能参与视网膜I/R损伤导致的RGCs丢失。先前研究表明,白... 详细信息

视网膜缺血/再灌注(I/R)是青光眼发病时重要的病理生理特征,将导致视网膜炎症和神经节细胞(RGCs)的死亡,目前仍缺乏有效靶点挽救RGCs。细胞焦亡是一种促炎性细胞程序性死亡形式,可能参与视网膜I/R损伤导致的RGCs丢失。先前研究表明,白藜芦醇能有效激活去沉默信息调节蛋白1(Sirtuin1,Sirt1),具有强大的抗炎能力,在许多视网膜退行性病变中具有神经保护的能力。然而白藜芦醇在视网膜缺血/再灌注中是否具有抗细胞焦亡的作用尚不清楚。目的:本研究旨在探讨白藜芦醇是否通过Sirt 1介导细胞焦亡参与RGCs的保护机制。方法:构建小鼠视网膜缺血/再灌注(I/R)模型,分别在视网膜I/R损伤后1、2、3天后检测细胞焦亡标志物确定细胞焦亡高峰;通过腹腔注射白藜芦醇,观察其对小鼠视网膜I/R后细胞焦亡、炎症小体以及视网膜胶质细胞活化的影响;通过LPS诱导鼠来源müller胶质细胞(r-mC)发生焦亡,体外探讨白藜芦醇对r-mC细胞焦亡的影响。结果:体内实验中小鼠视网膜I/R损伤后,细胞焦亡参与视网膜的退化进程,并在损伤后1天达高峰;白藜芦醇治疗减轻了小鼠视网膜I/R后RGCs的丢失,增加了视网膜的厚度,末端脱氧核苷酸转移酶d UTP切口末端标记(TUNEL)阳性细胞的数量减少,上调了表达下降的去沉默信息调节蛋白1(Sirt 1),并抑制Caspase-1的活化,GSDmD-N的裂解,NLRP3/TmS1/ASC炎症小体的组装以及炎性因子IL-1β的释放;此外,白藜芦醇给药后缓解了视网膜胶质细胞的活化。在体外实验中,白藜芦醇同样减轻了r-mC细胞的焦亡,挽救了细胞存活,减少了乳酸脱氢酶(LDH)的释放,碘化丙啶(PI)阳性和TUNEL阳性细胞数,并且抑制了NLRP3/GSDmD-N/TmS1/ASC/Caspase-1/IL-1β细胞焦亡通路。结论:我们的研究结果表明,细胞焦亡在急性I/R视网膜损害的早期起关键作用,为müller胶质细胞活化参与视网膜的炎症反应提供了新的证据,并且重要的是发现白藜芦醇可通过Sirt 1抑制胶质细胞活化从而抑制NLRP3炎症小体所诱导的细胞焦亡通路以保护视网膜细胞。

关键词：青光眼细胞焦亡 NLRP3 白藜芦醇 müller胶质细胞

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鸡胚视网膜基膜的免疫电镜的研究

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实验生物学报 1990年第1期23卷 57-69页

作者：刘黎周美云蒋丽珍中国科学院上海细胞生物学研究所

扫描电镜观察到鸡胚视网膜基膜(RBm)上的菊花样结构,经免疫胶体金透射电镜证实为müller胶质细胞的末端足,层粘连蛋白(laminin)分布在末端足的辐射臂及其周围的基膜上。培养的视网膜细胞,其神经纤维在RBm伸长,收缩了的müller细胞末端... 详细信息

扫描电镜观察到鸡胚视网膜基膜(RBm)上的菊花样结构,经免疫胶体金透射电镜证实为müller胶质细胞的末端足,层粘连蛋白(laminin)分布在末端足的辐射臂及其周围的基膜上。培养的视网膜细胞,其神经纤维在RBm伸长,收缩了的müller细胞末端足呈球状颗粒分布在神经纤维及其生长锥的上面和侧面。推测分布在müller细胞末端足的辐射臂及其周围基膜上的层粘连蛋白在体内可能与神经纤维生长的导向有关。

关键词：基膜扫描电镜 müller胶质细胞免疫胶体金透射电镜层粘连蛋白

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