跨膜蛋白Ttyh1在视网膜细胞形成及损伤修复中的作用研究

作     者：梁雅楠 

作者单位：延安大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑敏化;曹永策

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071003[理学-生理学] 

主      题：跨膜蛋白Ttyh1 视网膜 Müller胶质细胞 视网膜损伤修复 

摘      要：哺乳类动物视网膜由间脑的神经上皮向两侧突起形成视泡发育而来,是中枢神经系统的一部分。在发育过程中,视网膜前体细胞（Retinal progenitor cells,RPCs）依次分化出视网膜中的7种主要神经细胞类型:神经节细胞及水平细胞最先产生,其次是视锥细胞和无长突细胞,最后是视杆细胞、双极细胞和Müller氏胶质细胞,主要在出生后分化完成。7型细胞经过迁移后规则排列并建立突触联系,最终形成视网膜的三个核层（nuclear layers）及将它们联系起来的两个突触层（synaptic layers）,从而完成光信号的接收、转换和传导。视网膜丰富的细胞类型和规则的层次结构,是视觉功能实现的生物学基础。作为视网膜前体细胞产生的唯一一型胶质细胞,Müller胶质细胞在正常生理条件下发挥营养因子释放、细胞碎片吞噬、维持视网膜代谢与稳态等多种功能;在病理条件下则具有损伤反应能力,在损伤视网膜的信号传递和损伤修复过程中具有重要意义。尽管已揭示出调控视网膜发育及视网膜损伤后修复的多种细胞因子与信号通路,但仍有许多功能未知的视网膜特异表达基因可能在其中发挥作用。既往研究发现,跨膜蛋白Ttyh1在发育期视网膜中表达,并随着视网膜Müller胶质细胞的分化表现出显著而短暂的上调。跨膜蛋白Ttyh1在神经系统中对于神经干细胞干性维持、抑制静息/激活转换以及神经发生的作用已有明确阐述,但其在不同时期视网膜中的表达、功能以及对视网膜损伤修复的作用还未有深入研究。由此,本研究借助生物信息学分析及多种染色技术,揭示跨膜蛋白Ttyh1在视网膜中的表达模式;接着采用自主构建的Ttyh1敲除小鼠,探究其对视网膜各型细胞形成的影响;最后在Ttyh1敲除小鼠上建立视网膜兴奋性毒性损伤模型,明确其对Müller胶质细胞应对视网膜损伤反应的调控作用。主要研究内容及研究结果如下: 1、跨膜蛋白Ttyh1在发育期小鼠和成年小鼠视网膜中均有表达,在发育期视网膜中的表达主要集中于视网膜前体细胞和Müller胶质细胞。对胚胎14.5天的（embryonic day 14.5,E14.5）野生型胎鼠和出生后当天的（postnatal day 0,P0）野生型仔鼠视网膜组织的冰冻切片进行原位杂交染色,揭示Ttyh1在小鼠视网膜发育中表达,且表达集中于RPCs所在区域;对出生后4天（P4）和3个月（3 months,3M）野生型小鼠视网膜组织的冰冻切片进行免疫组织荧光染色,证实出生后早期和成体期小鼠视网膜的内核层均有跨膜蛋白Ttyh1的表达;利用GEO数据库现有的单细胞RNA测序数据,分析从E11到P14的视网膜发育期Ttyh1的表达谱。在E11-E18的视网膜胚胎发育期间,Ttyh1的表达主要集中于RPCs中;出生后自P2天起,Ttyh1的表达出现在Müller胶质细胞中;在P2到P5期间,随着Müller胶质细胞的分化,Ttyh1在Müller胶质细胞中的表达表现为短暂而剧烈的升高,后随发育进程的结束而下降。 2、Ttyh1敲除导致成年小鼠（3M）Müller胶质细胞数目显著增加,并持续至小鼠中老年期（10M）。在课题组前期自主构建的Ttyh1基因敲除小鼠上,通过不同生长阶段小鼠视网膜切片的H&E染色和细胞核荧光衬染,揭示Ttyh1敲除后小鼠视网膜的层次结构无显著变化;进而通过对不同年龄小鼠视网膜组成的7型细胞分别进行免疫荧光染色,发现与对照组小鼠相比,Ttyh1敲除后3M小鼠的Müller胶质细胞显著增多,其余感光细胞、神经节细胞和中间神经元数目未见显著差异。为判别这种变化是否为一过性的,我们进而分析了10M对照与敲除小鼠视网膜7型细胞,在10M敲除小鼠中观察到Müller胶质细胞具有更长的规律排列的神经突起延伸;随后利用GFAP抗体标记Müller胶质细胞终足,并使用SOX9抗体标记Müller胶质细胞细胞核,再次进行免疫荧光染色及数据统计,证实与对照组相比,Ttyh1敲除后3M及10M小鼠的视网膜Müller胶质细胞均显著增多。 3、Ttyh1敲除促进出生后早期视网膜前体细胞的增殖,并增强了Müller胶质细胞的分化过程。为了进一步确认上述Müller胶质细胞增多是否因分化增多所致,我们将表型分析追溯至发育期。通过对P4小鼠视网膜的Brd U掺入及染色以及Ki67增殖细胞免疫荧光染色,发现相比于对照组,Ttyh1敲除小鼠视网膜的Ki67细胞显著增多;随后利用SOX9抗体对P4小鼠视网膜进行Müller胶质细胞的免疫荧光染色。发现与对照组相比,Ttyh1敲除小鼠视网膜中停留在顶尖侧（Apical side）待迁移的Müller胶质细胞和已迁移至神经母细胞层内侧的Müller胶质细胞数目相当,而迁移中的Müller胶质细胞数目增多,表明Ttyh1的敲除促进了出生后早期RP