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aBIOTECH 2021年第2期2卷 105-116页

作者： Hong Li Xinyan Qin Pengyu Song Run Han Jigang Li State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry College of Biological SciencesChina Agricultural UniversityBeijing 100193China

Phytochromes are a family of photoreceptors in plants that perceive the red(R)and far-red(FR)components of their light *** exist in vivo in two forms,the inactive Pr form and the active Pfr form,that are interconvertible by treatments with R or FR *** is believed that phytochromes transduce light signals by interacting with their signaling partners.A GAL4-based lightswitchable yeast two-hybrid(Y2H)system was developed two decades ago and has been successfully employed in many studies to determine phytochrome interactions with their signaling ***,several pairs of interactions between phytochromes and their interactors,such as the phyACOP1 and phyA-TZP interactions,were demonstrated by other assay systems but were not detected by this GAL4 Y2H ***,we report a modified lexa Y2H system,in which the lexa DNA-binding domain is fused to the C-terminus of a phytochrome *** conformational changes of phytochromes in response to R and FR light are achieved in yeast cells by exogenously supplying phycocyanobilin(PCB)extracted from *** well-defined interaction pairs,including phyA-FHY1 and phyB-PIFs,are well reproducible in this ***,we show that our system is successful in detecting the phyA-COP1 and phyA-TZP ***,our study provides an alternative Y2H system that is highly sensitive and reproducible for detecting light-switchable interactions of phytochromes with their interacting partners.

关键词： Phytochrome Interaction Yeast two-hybrid lexa Light-switchable

铜绿假单胞菌lexa蛋白的纯化及免疫活性分析

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中国生物工程杂志 2007年第5期27卷 107-112页

作者：陈炫汤绍辉唐晖查庆兵刘芳暨南大学附属第一医院临床实验中心广州510632

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的lexa蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法:lexa基因片段插入表达载体pET32a(+),在***21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8mol/L尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex7... 详细信息

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的lexa蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法:lexa基因片段插入表达载体pET32a(+),在***21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8mol/L尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的lexa蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗lexa血清,采用免疫双扩、ELISA及Western blot分析lexa的免疫活性。结果:lexa以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的lexa具有良好的免疫活性。

关键词：铜绿假单胞菌 lexa 纯化免疫活性

铜绿假单胞菌SOS反应阻遏蛋白lexa的复性及活性研究

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中国生物工程杂志 2007年第9期27卷 19-23页

作者：陈炫汤绍辉查庆兵唐晖刘芳暨南大学附属第一医院临床实验中心广州510632

目的:对lexa蛋白复性方法进行优化,对复性后的lexa蛋白的生物学活性进行分析。方法:采用含有GSH/GSSG的缓冲液,一步稀释法对变性lexa蛋白进行复性,用镍离子亲合柱及阳离子柱层析法对复性后的lexa蛋白进行纯化,再以Sephadex G-25凝胶柱脱... 详细信息

目的:对lexa蛋白复性方法进行优化,对复性后的lexa蛋白的生物学活性进行分析。方法:采用含有GSH/GSSG的缓冲液,一步稀释法对变性lexa蛋白进行复性,用镍离子亲合柱及阳离子柱层析法对复性后的lexa蛋白进行纯化,再以Sephadex G-25凝胶柱脱盐,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和RP-HPLC法检测复性效果,Western blot分析复性前后及经DTT处理后的lexa蛋白的免疫反应性,凝胶滞留电泳试验检测复性lexa蛋白与DNA的特异性结合能力。结果:复性后的lexa蛋白出现单体和多聚体的形式,多聚体是由单条肽链聚合而成。lexa单体和多聚体与兔抗lexa多克隆抗体均有较好的反应性。复性后的lexa蛋白能与SOS盒序列发生特异性结合。

关键词：铜绿假单胞菌 lexa 复性

Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged lexa DNA-binding domain

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Advances in Bioscience and Biotechnology 2012年第5期3卷 626-629页

作者： Toshitsugu Fujita Hodaka Fujii Combined Program on Microbiology and Immunology Research Institute for Microbial Diseases Osaka University Suita Osaka Japan

Comprehensive understanding of mechanisms of epigenetic regulation requires identification of molecules bound to genomic regions of interest in vivo. We have developed a novel method, insertional chromatin immunoprecipitatin (iChIP), to isolate specific genomic regions retaining molecular interaction in order to perform non-biased identification of interacting molecules in vivo. Here, we developed a second-generation tagged lexa DNA-binding domain, 3xFNLDD, for the iChIP analysis. 3xFNLDD consists of 3 x FLAG tags, a nuclear localization signal (NLS), the DNA-binding domain (DB) and the dimerization domain of the lexa protein. Expression of 3xFNLDD can be detected by immunoblot analysis as well as flowcytometry. We showed that iChIP using 3xFNLDD is able to consistently isolate more than 10% of input genomic DNA, several-fold more efficient compared to the first-generation tagged lexa DB. 3xFNLDD would be a useful tool to perform the iChIP analysis for locus-specific biochemical epigenetics.

关键词： Insertional Chromatin Immunoprecipitation iChIP lexa FLAG Tag

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)lexa基因的克隆与原核表达

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基因组学与应用生物学 2018年第10期37卷 4315-4321页

作者：常云胜周维高增鸿丁燏广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

lexa是调节SOS反应的阻遏蛋白,而且与细菌耐药性的形成密切相关。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因lexa,并对lexa基因进行了生物信息学分析;构建了lexa基因的原核表达载体... 详细信息

lexa是调节SOS反应的阻遏蛋白,而且与细菌耐药性的形成密切相关。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因lexa,并对lexa基因进行了生物信息学分析;构建了lexa基因的原核表达载体PGEX-lexa,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达成功,还对lexa蛋白表达的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,lexa基因的开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸,lexa蛋白理论分子量为22.68 kD;重组蛋白表达的最优条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。

关键词：哈氏弧菌 lexa 基因克隆原核表达

大肠埃希菌过表达lexa基因对恩诺沙星杀菌力和抗药性突变的影响

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中国抗生素杂志 2013年第12期38卷 942-946页

作者：牛卫卫白华王进文颜世敢齐静骆延波李璐璐贾纪美李靖冉黄娟单虎刘玉庆山东省预防兽医学重点实验室青岛农业大学青岛266109 山东省农业科学院畜牧兽医研究所山东省动物疫病防治与繁育重点实验室济南250100 山东省畜牧兽医局济南250022

目的构建过表达SOS阻遏蛋白编码基因lexa的大肠埃希菌菌株,研究SOS应答对恩诺沙星抗药性突变的影响,并建立SOS应答抑制剂筛选平台。方法构建lexa重组表达质粒pET-22b(+)-lexa,转化大肠埃希菌BL21(DE3)构建重组质粒菌株BL21-lexa,用IPTG... 详细信息

目的构建过表达SOS阻遏蛋白编码基因lexa的大肠埃希菌菌株,研究SOS应答对恩诺沙星抗药性突变的影响,并建立SOS应答抑制剂筛选平台。方法构建lexa重组表达质粒pET-22b(+)-lexa,转化大肠埃希菌BL21(DE3)构建重组质粒菌株BL21-lexa,用IPTG诱导BL21-lexa过表达lexa,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定lexa蛋白,用荧光定量PCR测定SOS应答基因recA和umuC表达变化;然后用恩诺沙星梯度平板测定恩诺沙星对BL21-unmodified(空质粒菌株)和BL21-lexa的抑菌活性和抗药性突变率。结果重组质粒菌株BL21-lexa在IPTG诱导下过表达lexa,抑制recA和umuC表达,提高了大肠埃希菌对恩诺沙星的敏感性,降低了抗药性突变率。结论通过IPTG诱导BL21-lexa过表达lexa蛋白,能构建稳定的SOS应答抑制模型,用于筛选SOS抑制剂,提高恩诺沙星杀菌力和降低抗药性突变。

关键词： lexa SOS应答大肠埃希菌恩诺沙星抗药性突变质粒过表达

铜绿假单胞菌的lexa蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2007年第4期28卷 379-384页

作者：陈炫沙建平汤绍辉唐晖查庆兵刘芳暨南大学附属第一医院临床实验中心广东广州510632 第三军医大学临床微生物免疫教研室重庆400038

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白lexa进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化。方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的lexa基因,将此基因片段插入到表达载体pET32 a(+)上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达... 详细信息

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白lexa进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化。方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的lexa基因,将此基因片段插入到表达载体pET32 a(+)上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。包涵体洗涤后用8 mol/L尿素溶解,以镍离子亲合柱层析作为第1步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第2步精细纯化,反相高相液相色谱法(HPLC)测定蛋白的浓度。结果:lexa以包涵体形式表达,表达量为45%,经镍离子亲合柱层析纯化后lexa蛋白纯度达到85%以上,回收率大于80%,镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析两步纯化目的蛋白,经HPLC测定,最终目的蛋白的纯度为98.97%。结论:在pET32 a(+)表达系统中实现了PA的lexa蛋白的高效表达,两步纯化法获得高纯度的目的蛋白,为进一步鉴定lexa靶位点奠定了基础。

关键词：铜绿假单胞菌 lexa 纯化

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 lexa蛋白的表达、纯化及鉴定

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第三军医大学学报 2008年第12期30卷 1114-1117页

作者：沙建平邹全明张卫军杨珺毛旭虎郭刚罗萍刘开云陈洪章第三军医大学医学检验系临床微生物学及免疫学教研室重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的对EHEC O157∶H7 lexa进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法lexa基因片段插入表达载体pET22b(+),在***21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8 mol/L尿素溶解,Heparin Agrose亲合柱层析为第一步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步... 详细信息

目的对EHEC O157∶H7 lexa进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法lexa基因片段插入表达载体pET22b(+),在***21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8 mol/L尿素溶解,Heparin Agrose亲合柱层析为第一步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定lexa蛋白的浓度,将纯化的lexa蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗lexa血清,采用免疫双扩、ELISA及Western blot分析lexa的免疫活性。结果lexa以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经Heparin Agrose亲合柱层析和凝胶过滤层析两步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98%,表达及纯化的lexa具有良好的免疫活性。结论在***21(DE3)中表达的lexa蛋白具有良好的免疫活性。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157 lexa 纯化免疫活性

阻遏蛋白lexa参与变形假单胞菌毒力调控机制的研究

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阻遏蛋白LexA参与变形假单胞菌毒力调控机制的研究

作者：何荣超集美大学

学位级别：硕士

大黄鱼是我国四大海产之一,具有极高的经济价值;大面积的集约化养殖大黄鱼随之也带来了严重的病害。“内脏白点病”是近些年出现在网箱养殖大黄鱼中最常见的病害之一,大黄鱼感染后内脏出现白色结节,且患病大黄鱼死亡率极高,已造成严重... 详细信息

大黄鱼是我国四大海产之一,具有极高的经济价值;大面积的集约化养殖大黄鱼随之也带来了严重的病害。“内脏白点病”是近些年出现在网箱养殖大黄鱼中最常见的病害之一,大黄鱼感染后内脏出现白色结节,且患病大黄鱼死亡率极高,已造成严重的经济损失。目前,变形假单胞菌是导致大黄鱼“内脏白点病”的病原菌的观点得到广泛认可。变形假单胞菌广泛分布于海水中,是典型的条件致病菌,变形假单胞菌不仅能够感染大黄鱼,对其他多种水产经济鱼类都有一定感染性。近年来,变形假单胞菌感染的发病率显著增加,给我国水产养殖业带来了巨大经济损失。本实验室前期从患有“内脏白点病”的大黄鱼内脏中分离、鉴定了一株具有较强毒性的变形假单胞菌NZBD9菌株,并利用dual RNA-seq分析发现lexa可能参与变形假单胞菌的毒力调控机制。lexa首先在大肠杆菌中被鉴定为SOS反应中的一个关键转录调控因子,参与DNA损伤修复过程的调控,且在几乎所有细菌中都存在lexa基因,但关于lexa参与细菌毒力调控的相关研究目前仍罕见报道。因此,本研究围绕变形假单胞菌这一重要水产致病菌,对lexa基因在毒力调控中的作用与分子机制进行初步的研究。本研究主要包括以下内容:(1)采用温度、pH、丝裂霉素-C、HO以及重金属等胁迫处理变形假单胞菌NZBD9,并利用q RT-PCR检测lexa基因的表达情况,结果表明:lexa在4℃时表达水平显著下调,在44℃时表达水平显著上调;lexa在pH=4或者9时,表达水平显著下调;lexa在不同浓度的HO处理下,表达量均呈现下调趋势;在丝裂霉素-C处理下,lexa表达水平显著上调;在Cu、Pb胁迫处理后,lexa的表达水平显著下调。以上结果表明这些胁迫处理在转录水平上对lexa的表达具有显著影响,证明变形假单胞菌lexa在DNA损伤诱导因子之外的多种环境胁迫的应答中扮演重要角色。值得注意的是,在本研究中,丝裂霉素C作为一种DNA损伤诱导剂,促进了lexa的转录表达,这可能是lexa通过自我切割与降解的方式参与DNA损伤修复之后的一种反馈调节机制。(2)采用同源重组技术,构建lexa缺失突变菌株,并对突变株的粘附、生物被膜形成、运动、溶血、以及生长能力进行检测,分析lexa缺失突变对变形假单胞菌毒力表型的影响。结果显示,△lexa菌株的粘附能力和生物被膜形成能力显著下降;而△lexa菌株的运动、溶血以及生长能力与野生株无显著差异。以上结果表明,lexa参与了变形假单胞菌粘附和生物被膜形成的毒力调控。(3)为了进一步了解lexa对变形假单胞菌毒力的调控机制,我们对△lexa菌株进行转录组测序,获得了诸多毒力相关的差异表达基因,并发现包括鞭毛组装、细菌趋化以及生物被膜形成的多个通路在lexa缺失后受到显著影响。同时,我们围绕lexa开展了染色质免疫共沉淀测序(Chi P-seq),进而将Chi P-seq与转录组测序的结果进行关联分析,得到了lrg A、ton B等重要潜在靶基因,并对潜在靶基因进行q RT-PCR验证。最后,我们通过免疫共沉淀质谱联用技术(Co IP-MS)找到了可能与lexa具有潜在相互作用的Rec A、Htp G、Fur等蛋白。以上结果表明,lexa可能与Rec A、Htp G、Fur等蛋白一起,通过调控下游基因表达,进而影响变形假单胞菌的毒力。

关键词：水产病原变形假单胞菌毒力调控 lexa 粘附成膜

大肠杆菌DnaA和lexa蛋白影响ybfE基因的表达

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大肠杆菌DnaA和LexA蛋白影响ybfE基因的表达

作者：王树文内蒙古大学

学位级别：硕士

大肠杆菌DnaA蛋白既是复制起始蛋白也是转录调节因子,而lexa蛋白是SOS应激反应调控蛋白。.ybfE是功能未知的基因,有文献报道ybfE基因表达可能受lexa蛋白的调控。DnaA和lexa蛋白都是通过结合基因启动子区的保守序列DnaA-box或者lexa-box... 详细信息

大肠杆菌DnaA蛋白既是复制起始蛋白也是转录调节因子,而lexa蛋白是SOS应激反应调控蛋白。.ybfE是功能未知的基因,有文献报道ybfE基因表达可能受lexa蛋白的调控。DnaA和lexa蛋白都是通过结合基因启动子区的保守序列DnaA-box或者lexa-box来行使功能,我们通过序列分析了解到在ybfE启动子区有六个DnaA-box和一个lexa-box。本文为了探究DnaA和lexa蛋白对ybfE表达的影响,首先将报告基因lacZ插入到染色体ybfE基因启动子下游,然后用Miller的方法在不同DnaA或lexa蛋白水平的细胞中测定了p-半乳糖苷酶活性。进而分析DnaA和lexa蛋白对ybfE基因表达的影响。结果发现：过表达DnaA或者降低DnaA可用量,对ybfE基因的表达并没有明显的影响。但在dnaA345突变体中,ybfE基因的启动子活性明显高于野生型。在lexa3突变体和△lexa细胞中ybfE的启动子活性与野生型相比没有明显的变化。其次我们构建了ybfE启动子活性分析质粒,将ybfE的启动子基因插入到pTAC3953质粒上没有启动子的lacZ基因上游。在质粒水平我们同样检测了不同浓度的DnaA和lexa蛋白对ybfE基因表达的影响。并且我们对pTACYL质粒上的DnaA-box和lexa-box做了删除突变和多点突变。结果发现突变DnaA-box对ybfE的表达没有明显影响,突变lexa-box会导致ybfE的表达明显下降,然而突变lexa-box后在dnaA345细胞中ybfE基因的表达量较野生型细胞有明显的提高。此外我们体外进行了gel-shift实验,检测到lexa蛋白与.ybfE的启动子有作用。这些结果说明DnaA和lexa蛋白可能调控ybfE基因的表达。

关键词：表达调控 DnaA lexa 大肠杆菌 ybfE基因