检索结果-南通市图书馆

作者：樊思梨贵州中医药大学

学位级别：硕士

目的:探讨不同频次温和灸对动脉粥样硬化(AS)模型家兔脂质代谢相关蛋白的影响机制。方法:50只SPF级家兔适应性喂养一周后编号,按编号随机分为正常组13只、造模组37只。造模组家兔采用高脂饮食加免疫损伤法复制动脉粥样硬化模型。模型建... 详细信息

目的:探讨不同频次温和灸对动脉粥样硬化(AS)模型家兔脂质代谢相关蛋白的影响机制。方法:50只SPF级家兔适应性喂养一周后编号,按编号随机分为正常组13只、造模组37只。造模组家兔采用高脂饮食加免疫损伤法复制动脉粥样硬化模型。模型建立成功后,将造模组剩余36只家兔按编号随机分成模型组12只,高频次组12只,低频次组12只。在艾灸干预治疗期间所有家兔均给予普通饲料正常喂养。高频次组和低频次组家兔采取抓取捆绑方式固定,并以膻中、神阙、内关(双)和血海(双)穴位进行温和灸干预,高频次组每日治疗1次,低频次组隔日治疗1次,每次均治疗30min,共治疗4周;治疗期间正常组和模型组与治疗组一样抓取捆绑固定,但不予艾灸干预。艾灸干预期间观察各组家兔一般情况、食欲及大便的变化情况;干预结束后测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),计算TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C比值;采用光镜和电镜观察主动脉病理形态变化及超微结构;采用Western blot检测肝脏和主动脉AMPKα、lxrα和ABCA1蛋白的表达;Reαl time PCR检测肝脏和主动脉AMPKα、lxrα和ABCA1 mRNA的表达。结果:1.各组家兔一般情况在造模和艾灸干预过程中,与造模组相比,治疗组家兔毛发舒顺,两眼精神活泼,整体状态较好。各组家兔之间的食欲量没有明显的差别。在动物排泄物方面,模型组家兔存在粪便不成形情况;其余三组家兔除偶尔因天气变化引起腹泻外,其他时间排泄物成型性均较正常。2.各组家兔血脂水平及其比值的变化(1)血清TG含量变化:模型组家兔TG含量高于正常组,与正常组家兔比较,有显著统计学差异(P0.05)。(2)血清TC含量变化:模型组家兔TC含量明显高于正常组,与正常组家兔比较,有显著统计学差异(P0.05)(3)血清LDL-C含量变化:模型组家兔LDL-C含量明显高于正常组,与正常组家兔比较,存在显著统计学差异(P0.05)。温和灸治疗后家兔肝脏AMPKαmRNA和蛋白表达均显著升高,与模型组比较差异均有显著统计学意义(P0.05)。5.各组家兔主动脉和肝脏lxrαmRNA及蛋白表达水平模型组家兔主动脉lxrαmRNA和蛋白表

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炎症干扰细胞内胆固醇外排导致肝脏脂质异常积聚的分子机制

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作者：陈昱杨重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:采用皮下注射酪蛋白（Casein）诱导C57BL/6J小鼠体内产生慢性低丰度系统性炎症,研究在炎症状态下,胆固醇代谢紊乱导致肝组织损害及其相关分子机制。方法:选取24只8周龄雄性C57 BL/6J小鼠,随机分为普通饮食组（对照组,NCD）、... 详细信息

目的:采用皮下注射酪蛋白（Casein）诱导C57BL/6J小鼠体内产生慢性低丰度系统性炎症,研究在炎症状态下,胆固醇代谢紊乱导致肝组织损害及其相关分子机制。方法:选取24只8周龄雄性C57 BL/6J小鼠,随机分为普通饮食组（对照组,NCD）、炎症组（NCD+Casein）、高脂组（HFD）、高脂+炎症组（HFD+Casein）,每组6只。正常饮食组给予普通饲料喂养,高脂饮食组给予高脂饲料喂养（含15%脂肪, 1.25%胆固醇, 0.5%胆酸盐）。炎症刺激组予隔天皮下注射0.5 ml 10%酪蛋白溶液,非炎症刺激组予隔天皮下注射0.5 ml生理盐水,18周后处死小鼠,收集血清、肝脏、胆囊、小肠组织。采用ELISA法检测血清中炎症指标白介素-6（IL-6）、血清淀粉样蛋白（SAA）、肿瘤坏死因子α（TNFα）的浓度。结果:与对照组相比,给予炎症刺激的两组小鼠血清中IL-6、SAA、TNFα的浓度水平显著升高,差异具有统计学意义,而单纯高脂组炎症指标水平较对照组相比无明显差异。结论:隔日皮下注射酪蛋白18周,可诱导C57BL/6J小鼠体内产生慢性低丰度系统性炎症,本实验动物模型建立成功。目的:观察慢性低丰度系统性炎症状态下,C57BL/6J小鼠血清、肝脏、胆囊、小肠及HepG2细胞中脂质含量水平及胆固醇外排相关指标的变化情况,探讨炎症是否加重脂质诱导的肝损害。方法:将HepG2细胞分为以下4组:对照组（Control）、炎症组（TNFα）、高脂组（LDL）、高脂+炎症组（LDL+ TNFα）。用HE染色及油红O染色观察小鼠肝脏及HepG2细胞形态及脂质沉积情况。用化学酶促-比色法测定小鼠肝脏及HepG2细胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）、胆固醇酯（CE）的含量。用酶法测定小鼠血清TC、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）水平。用3[H]标记胆固醇-液体闪烁计数法检测HepG2细胞胆固醇外流量。用磷钼酸比色法检测小鼠肝脏、胆囊及近端小肠中胆汁酸水平。结果:肝组织HE染色显示,与对照组相比,炎症组与高脂组的肝脏组织结构紊乱,肝细胞内有明显脂滴积聚和少量空泡形成,而高脂+炎症组可见肝细胞大量空泡样变性及炎症细胞浸润。肝组织和HepG2细胞油红O染色显示,与对照组相比其余三组红染颗粒增多,且以高脂+炎症组最为明显。肝组织和HepG2细胞内胆固醇检测结果显示,与对照组相比其余三组TC、FC、CE含量均增加,且以高脂+炎症组最为显著（P＜0.05）。小鼠血清TC、LDL、HDL检测结果显示,高脂饮食增加了小鼠血清中三者的浓度,而无论给予正常饮食或高脂饮食,炎症刺激均能降低三者血清中的浓度（P＜0.05）。细胞内胆固醇外流测定结果显示,与对照组相比,高脂组胆固醇外流量增加而炎症组降低,高脂+炎症组较高脂组外流量明显减少（P＜0.05）。小鼠总胆汁酸水平检测结果显示,高脂组肝脏、胆囊及近端小肠中总胆汁酸水平较对照组增高,而高脂+炎症组与单纯高脂组相比,其水平降低（P＜0.05）。结论:慢性低丰度系统性炎症可引起C57BL/6J小鼠肝脏及HepG2细胞内脂质异常积聚,干扰了胆固醇外流及胆汁酸合成过程。目的:探讨炎症通过干扰过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）、肝X受体α（lxrα）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）、胆固醇7α羟化酶1（CYP7A1）介导的胆固醇外排致肝内脂质积聚的分子机制。方法:在前面两个部分所建立的小鼠及细胞模型上,采用实时定量PCR（Real-Time PCR）法和蛋白免疫印迹（Western Blotting）法分别检测小鼠肝脏和HepG2细胞中PPARα、PPARγ、lxrα、ABCA1、CYP7A1等基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:Real-Time PCR结果表明,无论在小鼠肝脏或HepG2细胞中,与对照组相比,高脂组中PPARα、PPARγ、lxrα、ABCA1、CYP7A1的mRNA表达显著上调,炎症组表达则下调,而高脂+炎症组中上述各基因的mRNA表达水平较高脂组明显下降（P＜0.05）。Western Blotting结果显示蛋白表达情况与基因相符。结论:炎症应激可以通过下调肝脏中PPARα/PPARγ-lxrα-ABCA1/CYP7A1的表达,抑制胆固醇的外流和胆汁酸合成,加重脂质在肝脏的沉积从而引起肝损害。

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PPARs激动剂对THP-1巨噬细胞ABCA1表达及胆固醇流出的影响

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作者：甘淋第三军医大学

学位级别：硕士

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是世界上死亡率最高的疾病之一,无论是在发展中国家还是在发达国家,主要表现为病变组织中胆固醇的堆积,并伴有大量泡沫细胞的形成。ATP结合盒转运子A1( ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)... 详细信息

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是世界上死亡率最高的疾病之一,无论是在发展中国家还是在发达国家,主要表现为病变组织中胆固醇的堆积,并伴有大量泡沫细胞的形成。ATP结合盒转运子A1( ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)是一个抗AS基因,它能促进细胞中胆固醇的流出,并抑制AS的发生发展。人的ABCA1基因定位于9q3.1,包括了50个外显子和49个内含子,编码2261个氨基酸残基。它在人的许多组织都高表达,如胚胎、肝、肾上腺、肺和胎儿组织。巨噬细胞中胆固醇流入能上调它的表达,而HDL3介导的胆固醇流出则能抑制其表达。ABCA1缺乏能导致丹吉尔病和家族性HDL缺乏症,表现为胆固醇酯在各种组织中聚集。在脂质负荷的巨噬细胞中ABCA1表达增高,能促进细胞内的胆固醇流出到胞外的载脂蛋白AI或者HDL上。作为胆固醇逆转运过程的第一步,ABCA1的激活还能调节与AS发生关系密切的血浆HDL的浓度。过氧化物酶体增殖激活性受体(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一种调控脂质和糖类代谢的核受体,包括PPARα, PPARβ(σ)和PPARγ三种亚型。PPARα在肝脏、心脏、肌肉、肾脏和动脉管壁的各种细胞如内皮细胞和巨噬细胞中表达较高。PPARβ表达广泛,但是至今仍没有发现有特定的配体,目前的研究很少。PPARγ高表达于白色脂肪组织、免疫系统和小肠中。PPARs在和其配体结合后,PPARs的转录活性会发生改变,继而与另一种核受体视黄醇类X受体(retinoid X receptor,RXR)结合形成异二聚体,从而作为配体激活的转录调节基因发挥作用。现有大量研究指出PPARs具有抗AS的作用。 lxrs也是核受体超家族的一员,在调节脂质代谢的过程中起着关键的作用。lxrs对细胞内胆固醇的升高非常敏感,胆固醇浓度的升高会激活lxrs,进而诱导一系列参与胆固醇吸收、流出和转运的基因发生表达。除了参与脂质代谢的功能,lxrs还能在巨噬细胞中调节免疫和炎症反应。它分为lxrα和lxrβ两种亚型。lxrs一般与RXR生成异二聚体,识别并结合特异性DNA反应元件而发挥作用。基因表达证实lxrα能调节肝脏、巨噬细胞和小肠内胆固醇和脂肪酸代谢中大量的靶基因。lxrα高表达于代谢旺盛的组织如肝脏,且能被脂肪酸所调节,这些都指出lxrα在脂质代谢中的作用非常重要。本实验以THP-1源性巨噬细胞为研究对象,研究PPARα激动剂氯贝丁酯(clofibrate)对THP-1源性巨噬细胞lxrα表达的影响;并进一步研究了氯贝丁酯和PPARγ的激动剂曲格列酮(troglitazone),对THP-1源性巨噬细胞中ABCA1表达及胆固醇流出的影响,从而探讨PPARs激动剂在AS防治中的作用机制。本研究主要结果总结如下: 1.用一次性密度梯度超速离心法从人新鲜血清中分离了高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)。并用二价铜离子诱导LDL氧化,得到氧化型LDL(ox-LDL),用0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定HDL、LDL和ox-LDL。 2.人THP-1单核细胞在使用200nmol/L佛波酯(PMA)作用48小时后诱导生成巨噬细胞。用PPARα激动剂氯贝丁酯刺激巨噬细胞不同时间(0, 4, 8, 12和24小时)后,采用RT-PCR法发现lxrαmRNA水平表达随着氯贝丁酯作用时间的延长而具有时间依赖型的表达增加;采用Western Blot法分析得到巨噬细胞中lxrα的蛋白质表达也随着氯贝丁酯作用时间延长而时间依赖型的表达增加。 3.用PPARα激动剂氯贝丁酯和PPARγ激动剂曲格列酮分别作用巨噬细胞0, 4, 8, 12和24小时后,采用半定量RT-PCR和Western Blot法得出巨噬细胞中ABCA1 mRNA水平和蛋白质水平表达均随着氯贝丁酯或曲格列酮作用时间的延长而表达增加,且表现为时间依赖型。 4.用50mg/L ox-LDL和0.2mCi/L [3H]标记的胆固醇负荷THP-1源性巨噬细胞24小时后,使之诱导形成泡沫细胞,采用胆固醇流出实验检测氯贝丁酯和曲格列酮刺激泡沫细胞的胆固醇流出率。证实在氯贝丁酯和曲格列酮分别作用0, 4, 8, 12和24小时后泡沫细胞的胆固醇流出均有增加,且都表现为时间依赖型的增加。实验证实PPARα激动剂氯贝丁酯能时间依赖性的上调lxrα的表达,同时实验还证实PPARα激动剂氯贝丁酯和PPARγ的激动剂曲格列酮分别在mRNA水平和蛋白质水平能上调ABCA1的表达,并能促进THP-1源性泡

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DOCK5基因对肝脏甘油三酯代谢的影响及其机制研究

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作者：许秋燕重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分体外分析DOCK5对肝细胞脂代谢的影响目的:体外改变DOCK5表达证实其对肝细胞脂代谢的影响。方法:构建DOCK5过表达质粒和抑制腺病毒,感染Hepa1-6细胞,使用FFAs诱导肝细胞脂肪变性造高脂模型。提取RNA和蛋白,PCR法测定肝脏脂质代... 详细信息

第一部分体外分析DOCK5对肝细胞脂代谢的影响目的:体外改变DOCK5表达证实其对肝细胞脂代谢的影响。方法:构建DOCK5过表达质粒和抑制腺病毒,感染Hepa1-6细胞,使用FFAs诱导肝细胞脂肪变性造高脂模型。提取RNA和蛋白,PCR法测定肝脏脂质代谢相关基因CD36、FATP2、FATP4、FATP5、FABP4、ACC、chREBP、FAS、SCD-1、SREBP1、Acox1、CPT-1、MCAD、PPARα、ApoB、MTTP、lxrα、PPARγ、PXR、RXRs等mRNA的变化,Western blot法测定肝脏脂质代谢相关基因SREBP1、FAS、CD36、PPARα、lxrα、PPARγ等蛋白的变化。结果:构建DOCK5过表达质粒和抑制腺病毒并成功感染Hepa1-6细胞。与对照组相比较,DOCK5过表达时,脂肪酸摄取相关基因CD36、脂肪酸合成相关基因FAS、SREBP1显著下降,而脂肪酸摄取相关基因FATPs、FABP4,脂肪酸合成相关基因ACC、chREBP、SCD-1,脂肪酸β氧化相关基因Acox1、CPT-1、MCAD、PPARα,VLDL分泌相关基因ApoB、MTTP等无明显变化。其次,DOCK5过表达组核受体基因lxrα、PPARγ表达明显下降。然而,DOCK5表达受抑制时,脂肪酸摄取相关基因CD36、脂肪酸合成相关基因FAS显著升高,和CD36相关的肝核受体家族成员lxrα、PPARγ表达明显升高,其他脂质代谢相关的基因无明显变化。结论:DOCK5参与调控肝脏脂质代谢,这一过程可能与lxrα、PPARγ、FAS和CD36的表达密切相关。第二部分DOCK5基因敲除引起高脂诱导的肝细胞脂肪变性目的:通过对比研究DOCK5敲除鼠和野生鼠,进一步探讨DOCK5调控肝脏脂质代谢的潜在机制。方法:首先分离培养DOCK5敲除鼠和C57野生鼠原代肝细胞,并用FFAs和BSA进行模型,油红O染色观察肝细胞内脂滴的含量,试剂盒测定肝脏甘油三酯等含量。提取原代肝细胞RNA和蛋白,PCR法检测肝脏脂质代谢相关基因(脂肪酸摄取、合成、氧化和VLDL分泌相关指标)的m RNA变化,Western blot法测定肝脏脂代谢相关基因CD36、FAS、SREBP1等蛋白的变化。其次,分离C57野生鼠原代肝细胞培养,转染DOCK5过表达质粒,检测上述脂代谢相关指标的表达情况。结果:DOCK5敲除鼠的FFAs组肝细胞内脂滴及TG的含量显著高于C57野生鼠对照组;DOCK5-/--FFAs组脂肪酸摄取相关基因CD36、脂肪酸合成相关基因FAS、SREBP1的m RNA和蛋白较野生鼠显著升高(Plxrα和PPARγ的m RNA和蛋白表达上调(Plxrα和PPARγ的m RNA和蛋白表达下降。结论:DOCK5基因敲除鼠能引起高脂诱导的肝细胞脂肪变性,可能与脂肪酸摄取相关基因CD36和肝核受体lxrα、PPARγ的表达变化密切相关。第三部分DOCK5调控肝脏甘油三酯代谢的机制研究目的:探索DOCK5调控肝脏甘油三酯代谢的机制研究。方法:首先分离培养CD36-/-原代肝细胞,转染DOCK5过表达质粒/抑制腺病毒,FFAs造肝细胞脂肪变性模型。油红O染色观察肝细胞脂滴多少,试剂盒测定甘油三酯含量,验证DOCK5是否通过CD36来调控肝细胞脂质代谢。其次,免疫荧光法检测DOCK5在肝细胞的定位,验证DOCK5是在细胞核或质内进行参与调控肝脏脂质代谢。最后,构建CD36基因启动子截短质粒,利用双荧光素酶报告基因分析DOCK5基因对CD36基因启动子的调控作用。结果:在CD36-/-原代肝细胞中,DOCK5表达上下调均不能影响细胞内脂滴和TG含量。细胞免疫荧光结果发现:DOCK5表达于肝模型Hepa1-6细胞的细胞质、细胞核中且主要位于细胞质,是一种胞质蛋白。我们成功构建CD36启动子截短质粒,双荧光素酶报告基因分析显示,与空载质粒相比,加入DOCK5过表达质粒后,CD36基因启动子的活性明显降低(PlxrE结合元件。结论:DOCK5通过作用于CD36基因启动子的lxr元件调控CD36的表达,从而影响肝细胞脂质代

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ABCG1对糖脂代谢异常的动脉粥样硬化大鼠血脂的影响及胃饥饿素（Ghrelin）调控机制的研究

ABCG1对糖脂代谢异常的动脉粥样硬化大鼠血脂的影响及胃饥饿素（G...

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作者：付洁琦沈阳医学院

学位级别：硕士

目的探讨ATP结合盒转运体G1(ABCG1)对糖脂代谢异常的动脉粥样硬化(AS)大鼠血脂的影响及胃饥饿素(Ghrelin)可能的调控机制。方法健康的雄性Wistar大鼠,实验前编号称重(250±50)g。将它们随机分为5组,即A、B、C、D、E组,即高脂组(B组,高... 详细信息

目的探讨ATP结合盒转运体G1(ABCG1)对糖脂代谢异常的动脉粥样硬化(AS)大鼠血脂的影响及胃饥饿素(Ghrelin)可能的调控机制。方法健康的雄性Wistar大鼠,实验前编号称重(250±50)g。将它们随机分为5组,即A、B、C、D、E组,即高脂组(B组,高脂肪饮食+动脉内膜损伤),高糖组(C组,高脂肪饮食+动脉内皮损伤+糖尿病),Ghrelin组(D组,高脂肪饮食+动脉内皮损伤+糖尿病+Ghrelin),瑞舒伐他汀组(E组,高脂肪饮食+动脉内皮损伤+糖尿病+瑞舒伐他汀),并设置假手术组为对照组(A组,正常饮食),成功建立模型后,每组大鼠10只。喂养2周后,D组给予Ghrelin 100μg·kg-1·d-1(浓度1OOμg/ml),每日一次腹腔注射,E组给予瑞舒伐他汀100μg·kg-1·d-1(浓度100μg/ml),每日一次灌胃,其余各组给予生理盐水1OOμg kg-1·d-1(浓度1OOμg/ml),每日一次腹腔注射,干预6周后取材。取材前称重、测量血糖情况,并采用心脏取血的方式,进行血脂的检测:甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)。应用HE染色的方法检测大鼠颈部动脉血管的内膜厚度、中膜厚度以及内膜中膜厚度比。Western-blot法检测相关因子蛋白表达:Ghrelin、ABCGl、Toll样受体4(TLR4)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARy)、肝X受体(lxrα)。结果各组HE染色结果:与A组比较,B、C组颈动脉内膜、内膜中膜厚度比明显增高(P0.05)。各组体重水平:与A组比较,B组体重明显增高(P0.05);与D组比较,E组体重无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。各组血糖水平:与A组比较,B组血糖无明显差异(P>0.05),C组血糖明显增高(P0.05);与D组比较,E组血糖无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。各组血脂水平:与A组比较,B、C组血清TC、TG、LDL明显升高,HDL明显降低(P0.05)。与A组比较,B组PPARγ、ABCG1、Ghrelin蛋白表达明显降低(Plxrα蛋白表达无明显差异,无统计学意义(P>0.05);C组TLR4蛋白表达明显升高,PPARγ、lxrα、ABCG1、Ghrelin蛋白表达明显降低(Plxrα、ABCG1、Ghrelin蛋白表达明显降低(Plxrα、ABCG1、Ghrelin蛋白表达明显升高(Plxrα、ABCG1蛋白表达明显升高(P0.05)。与D组比较,E组Ghrelin蛋白表达明显降低(Plxrα、ABCG1蛋白表达无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。结论1.采用球囊损伤内膜结合高脂喂养方法制造AS模型成功,应用链脲佐菌素制造糖尿病(DM)模型成功。与A组相比,B、C组颈动脉内膜中膜厚度比增加,血脂增高,ABCG1蛋白表达明显降低,并且C组更为明显,提示糖脂代谢异常可以促发AS形成,且高血糖或DM可经血脂代谢紊乱和ABCG1途径加速或促发AS进程,为AS防治提供一个新的方向。2.相关性分析证实Ghrelin与TLR4具有负相关关系,可能是TLR4上游;且ABCG1是胆固醇外排的重要因子,其与血脂(LDL)呈负相关关系

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SIRT6对adropin合成与分泌的影响及机制研究

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作者：郭树森华中科技大学

学位级别：硕士

研究背景:肥胖和2型糖尿病的发病率逐年升高,目前仍然没有理想的治疗药物。生活方式的改变如高热量饮食和运动量减少是引起近年来肥胖和2型糖尿病发病率升高的重要原因。最新的研究发现,热量限制饮食和有氧运动都能使SIRT6和adropin的... 详细信息

研究背景:肥胖和2型糖尿病的发病率逐年升高,目前仍然没有理想的治疗药物。生活方式的改变如高热量饮食和运动量减少是引起近年来肥胖和2型糖尿病发病率升高的重要原因。最新的研究发现,热量限制饮食和有氧运动都能使SIRT6和adropin的表达升高,肥胖患者肝脏的SIRT6下降,血清adropin水平也降低。SIRT6和adropin通过调控肝脏脂质代谢和胰岛素敏感性,在能量代谢中发挥重要作用,有望成为治疗肥胖和糖尿病的新靶点。然而并没有研究报道他们之间的联系。研究目的:探寻SIRT6和adropin之间的关系及影响机制,以及对部分相关脂代谢分子的调控作用。研究方法:使用腺病毒-SIRT6对Hep G2细胞进行转染,Western Blot检测细胞SIRT6的表达水平,建立过表达SIRT6的细胞模型。实验分为四组,分别为:空白对照组,过表达SIRT6细胞组,正常细胞+PA(棕榈酸)组,过表达SIRT6细胞+PA组,其中PA干预24h。用ELISA试剂盒检测肝细胞培养基上清液的adropin浓度,Western Blot检测细胞内adropin蛋白的表达变化,q PCR检测编码adropin的能量平衡相关基因(Enho)及其上游相关因子RXRα和lxrα的m RNA的变化,检测相关脂代谢分子如CD36,APOE,LIPE和SREBP2的m RNA水平变化。结果:向Hep G2细胞加入腺病毒-SIRT6,转染细胞24h后,SIRT6高表达;细胞过表达SIRT6后培养基上清液中adropin分泌增加,PA干预的过转染组升高更明显,未转染细胞PA干预后培养基上清液adropin水平的增高无统计学差异。过表达SIRT6组细胞adropin合成增加,其中PA干预的过表达SIRT6组细胞adropin合成增加更显著,此外,PA干预的空白组细胞adropin合成也升高;与对照组相比,过表达SIRT6组细胞CD36,SREBP2,LIPE和APOE的转录水平无明显变化,而PA干预的过表达SIRT6组细胞,这些因子的表达显著增加。结论:SIRT6调控adropin的合成和分泌:过表达SIRT6能促进细胞adropin的表达和分泌,PA不能增强过表达的SIRT6对adropin的调控作用;SIRT6对adropin的调控并不是通过RXRα和lxrα通路;过表达SIRT6能增强PA诱导Hep G2细胞CD36,APOE,LIPE和SREBP2的转录水平变化。

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高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-小鼠肝脏脂代谢相关基因的表达研究

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作者：杜慧山东师范大学

学位级别：硕士

动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种多因素引起的疾病,涉及遗传、代谢和环境等诸多因素。研究表明,饮食在AS发生、发展和演变过程中起着重要作用。因此,针对饮食影响AS发生机制以及病变过程的研究,将有助于发现新的预防和治疗手... 详细信息

动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种多因素引起的疾病,涉及遗传、代谢和环境等诸多因素。研究表明,饮食在AS发生、发展和演变过程中起着重要作用。因此,针对饮食影响AS发生机制以及病变过程的研究,将有助于发现新的预防和治疗手段。研究显示,对易患AS的动物喂以富含饱和脂肪酸与胆固醇的的饮食可以增加心血管病的发生率。长期消耗高脂饮食可以导致AS相关的血脂代谢紊乱,这是一种代谢综合症的形式,以高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高胰岛素血症和其它的AS危险因子为特征[1]。肝脏是研究脂类代谢的重要靶器官。作为内源性和外源性脂代谢途径的交汇点及调节中心,肝脏能够合成、释放各种脂蛋白及脂代谢酶类,在脂类代谢平衡中发挥着重要作用。载脂蛋白E(apolipoprotein E, apoE)缺失(apoE-/-)小鼠对富含胆固醇的脂蛋白清除障碍,从而导致血浆总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)水平增高,并促使泡沫细胞形成,堆积于血管壁内,因此普通饮食喂养的apoE-/-小鼠在幼龄时即表现为血脂代谢紊乱以及自发性AS,并随年龄增长逐渐加重。高脂高胆固醇饮食是导致AS发生发展的重要因素。尽管高脂高胆固醇饮食导致脂代谢紊乱的研究开展的较多,但是其分子机制尚不清楚。高脂高胆固醇饮食对这些过程及代谢综合症的形成,与相关基因的表达变化密切相关。许多转录因子能够对不同的饮食刺激产生应答,例如过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα, PPARα)和肝X受体α(liver X receptorα, lxrα)。到目前为止,尚不清楚这些转录因子在高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-小鼠中对基因表达所起的作用,因此,本实验针对饮食与肝脏脂代谢紊乱的关系以及涉及的可能致脂代谢紊乱的作用机制等问题,采用经典的AS小鼠模型,探讨了高脂高胆固醇饮食对肝脏PPARα、lxrα及其靶基因的影响,以及它们在调控脂代谢中的作用,为饮食影响脂代谢紊乱发病机制的研究及AS治疗提供理论依据和研究平台。方法:本实验分析了PPARα、lxrα及其靶基因在幼龄apoE-/-小鼠及相同遗传背景的同龄野生型(wide type, WT)小鼠肝脏中的表达特征及其与血脂紊乱和AS早期病变的关系,利用半定量和实时定量RT-PCR技术,检测21天龄、1、2和3月龄apoE-/-小鼠及WT小鼠肝脏脂代谢相关基因的表达,并进行血生化指标及肝脏和主动脉病理形态学检测。通过实验得到如下结果: 1.利用半定量RT-PCR在肝脏中检测了8条脂代谢相关基因。在高脂高胆固醇饮食的作用下,lxrα、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)、血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like protein 3, Angptl3)在8周龄和12周龄的apoE-/-和WT小鼠中均显著上调。在apoE-/-小鼠组内,载脂蛋白AIV(apolipoprotein AIV, apoAIV)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-COA desalurase-I, SCDI)、载脂蛋白B100(apolipoprotein B100, apoB100)在8和12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著上调,肉碱棕榈酰转移酶I(carnitine palmitoyl transferase I, CPTI)和酰基辅酶A氧化酶1 (acyl coenzyme A oxidase 1, ACOX1)在4和 8周龄时显著下调。在WT小鼠组内,CPTI在8和12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著上调,apoAIV、SCDI和apoB100的表达没有明显的变化。 2.利用荧光实时定量RT-PCR检测了肝脏中6条脂代谢相关基因。在apoE-/-小鼠组内,PPARα的表达量在12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著下调,在WT小鼠组中,PPARα的表达量在12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著上调。高脂高胆固醇饮食显著下调了apoE-/-小鼠载脂蛋白A I(apolipoproteinA I, apoAI),B类清道夫受体I(scavenger receptor class B type I, SR-BI)和载脂蛋白AV(apolipoprotein AV, apoAV)的表达。而在WT小鼠中,apoAI和apoAV的表达量没有明显的变化,SR-BI的表达显著上调。脂蛋白脂酶(lipoprteinlipase, LPL)和脂肪酸转运体(fatty acid transloca

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胆酸对代谢性炎症模型大鼠糖脂代谢及炎症的影响

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作者：孙苗内蒙古农业大学

学位级别：硕士

目的:探讨胆酸对代谢性炎症模型大鼠糖脂代谢及炎症的影响,揭示胆酸对代谢性炎症的调控机理,从而为研究宠物新型抗代谢性炎症药物提供试验基础。方法:试验用饲喂高脂饲料60d的SD大鼠建立代谢性炎症模型,并以饲喂基础饲料的SD大鼠作为对... 详细信息

目的:探讨胆酸对代谢性炎症模型大鼠糖脂代谢及炎症的影响,揭示胆酸对代谢性炎症的调控机理,从而为研究宠物新型抗代谢性炎症药物提供试验基础。方法:试验用饲喂高脂饲料60d的SD大鼠建立代谢性炎症模型,并以饲喂基础饲料的SD大鼠作为对照。将大鼠分为五组,即模型组,胆酸高、中、低剂量组,阴性对照组,连续灌胃给药30 d,分别在停药第1天、3天检测葡萄糖耐量及胰岛素耐量,停药第5天采取大鼠血清,采用全自动生化分析仪检测天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）活性,白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、三酰甘油（TG）;采用生化试剂盒检测游离脂肪酸（FFA）、总胆酸（TBA）;El ISA试剂盒检测单核细胞趋化因子1（MCP-1）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）的含量;实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP-1α）、白介素10（IL-10）、白介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子（TNF-α）表达量;称量大鼠给药前后体重,计算给药后大鼠增重率;试验结束时处死大鼠测定脂肪湿重（WAT）,并计算脂肪系数;HE染色法肝脏组织切片,观察肝脏组织病理学变化;用免疫组化法检测过氧化物酶提增殖物激活受体α（PPARα）及肝X受体α（lxrα）的分布及表达。结果表明:与阴性对照组相比,模型组增重率、脂肪系数、WAT、TG含量、MIP-1α及IL-8的表达量极显著升高（P＜0.01）、MCP-1的含量、TNF-α的表达量及ALP活性显著升高（P＜0.05）;与模型组相比,胆酸高剂量组增重率、MIP-1α、IL-10及IL-8表达量、WAT、FFA、TG含量极显著降低（P＜0.01）,胆酸中、低剂量组的ALP活性、FFA含量及IL-10表达量显著降低（P＜0.05）,MIP-1α及IL-8表达量极显著降低（P＜0.01）,胆酸中剂量组的增重率及TNF-α的表达量显著降低（P＜0.05）。PPARα及lxrα受体均分布在肝细胞核,模型组PPARα表达量较阴性对照极显著下降（P＜0.01）,胆酸高、中剂量组PPARα表达量较模型组极显著上调（P＜0.01）、低剂量组显著上调（P＜0.05）,胆酸高、中、低剂量组较模型组lxrα表达量极显著下调（P＜0.01）。大鼠口服葡萄糖后120 min时,模型组血糖值较阴性对照组显著上升（P＜0.05）,而较胆酸高、中、低剂量组极显著降低（P＜0.01）。腹腔内注射胰岛素后120分钟时,模型组血糖值较阴性对照组显著上升（P＜0.05）,胆酸高剂量著降低（P＜0.05）。表明胆酸对代谢性炎症模型大鼠具有降脂、抑制体重增长并改善胰岛素敏感性的作用;胆酸能够通过上调PPARα、下调lxrα的表达,抑制脂肪生成,从而降低代谢性炎症模型大鼠的炎症反应。

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Formononetin和C-3-G调控雌激素SULT代谢的作用及机制研究

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作者：刘范晔河南大学

学位级别：硕士

实验目的:雌激素在体内有着重要的生理作用,雌激素水平紊乱将导致多种疾病的发生,磺酸基转移酶（Sulfotransferases,SULTs）介导的磺酸化代谢（SULT代谢）是机体清除雌激素的重要途径,因此明确影响雌激素SULT代谢的关键因素十分必要。... 详细信息

实验目的:雌激素在体内有着重要的生理作用,雌激素水平紊乱将导致多种疾病的发生,磺酸基转移酶（Sulfotransferases,SULTs）介导的磺酸化代谢（SULT代谢）是机体清除雌激素的重要途径,因此明确影响雌激素SULT代谢的关键因素十分必要。酚性物质广泛存在于各种中药,具有多种药理活性,极具药物开发价值,因此探究其体内作用机制具有重要意义。本课题组及其他学者前期研究表明以芒柄花素（Formononetin,For）和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside,C-3-G）为代表的酚性物质是多种核受体激动剂,且具有调控II相代谢酶（如葡萄糖醛酸转移酶和磺酸基转移酶）的作用。因此本课题组有理由推测,富含酚性物质的中药可能通过作用于核受体,从而调控代谢酶活性及表达,影响内源性物质代谢,进而发挥药理作用。本文将阐明Formononetin和C-3-G调控SULTs酶及雌激素代谢的分子机制,为雌激素水平过高所导致的相关疾病治疗提供新思路和方向。实验方法:1、基于细胞模型（Hep G2和Huh-7细胞）,采用Real-time PCR（RT-PCR）法测定核受体lxrα和RXRα的m RNA的表达情况;采用Western blot（Wb）法测定lxrα、RXRα、SULT1E1和SULT1A1的蛋白表达情况。2、利用液相质谱鉴定雌二醇的磺酸化代谢物;从细胞水平探究Formononetin和C-3-G对SULTs酶表达及活性的调控作用:运用体外酶孵育法,利用细胞裂解液和重组酶,评价Formononetin和C-3-G对SULTs酶活性的影响;运用RT-PCR实验方法,评价Formononetin和C-3-G对SULTs酶m RNA的作用;运用Wb实验方法,评价Formononetin和C-3-G对lxrα、SULTs酶及其他雌激素代谢相关的调控因子【1型17β羟基甾体脱氢酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenases-1,17β-HSD1）和磺酸苷水解酶（Sulfatase,STS）】表达的影响;利用瞬时转染法,建立lxrα/RXRα过表达或敲低的细胞模型,评价Formononetin对SULTs酶的调控与lxrα/RXRα蛋白的依赖性。3、从动物水平探究Formononetin对SULTs酶的调控作用:连续4周以灌胃的方式给予小鼠不同浓度的Formononetin和lxrα激动剂,探究其对小鼠肝脏中SULTs酶、lxrα及其他雌激素代谢相关蛋白表达水平的影响;通过ELISA实验检测经药物处理后小鼠血清中雌激素水平的变化。4、探究Formononetin对SULTs酶调控的分子机制:通过Co-IP实验验证Formononetin对lxrα与RXRα异源二聚体的影响;运用双荧光素酶报告基因和Ch IP实验方法,解析lxrα/RXRα与SULTs酶启动子结合位点。实验结果:1、核受体lxrα和RXRα,SULT1E1和SULT1A1均在Hep G2和Huh-7细胞中表达。2、Hep G2和Huh-7细胞裂解液可催化雌二醇发生SULT代谢,Formononetin和C-3-G可促进雌二醇的SULT代谢并呈浓度依赖性。3、基于Hep G2和Huh-7细胞研究表明,Formononetin和C-3-G显著上调SULT1E1和SULT1A1的蛋白表达,并且下调STS和17β-HSD1的蛋白表达;此外,Formononetin和C-3-G可显著提高细胞中SULT1E1和SULT1A1的m RNA表达水平。4、动物水平:分析ELISA实验的数据,Formononetin和lxrα激动剂均可使小鼠血清中雌激素降低;Formononetin可以促进小鼠肝脏中lxrα、SULT1E1和SULT1A1的表达,并抑制STS和17β-HSD1的表达。5、Ch IP、Co-IP及荧光素酶报告基因实验结果表明,Formononetin可促进lxrα在SULT1E1和SULT1A1的启动子富集,并促进lxrα与RXRα异源二聚体的形成;Formononetin促进lxrα与SULT1E1启动子直接结合并激活其转录活性,其位点在-2198～-2217 bp基因序列中,而RXRα与SULT1A1启动子结合并激活其转录活性,其位点在-1620～-1610 bp基因序列中。实验结论:Formononetin和C-3-G可通过作用于lxrα/RXRα,增强SULT1E1和SULT1A1启动子转录活性,促进雌激素SULT代谢,进而降低体内雌激素水平。

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土木香内酯调控lxrs-STAT3信号通路改善肝纤维化进程的研究

土木香内酯调控LXRs-STAT3信号通路改善肝纤维化进程的研究

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作者：王歌延边大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探究土木香内酯(Alantolactone,ALA)通过介导lxrs-STAT3交叉对话改善硫代乙酰胺(TAA)诱导小鼠肝纤维化的作用机制,为肝纤维化的临床药物治疗提供有效的理论依据。方法:体外实验选用肝星状细胞(HSCs和LX-2),预先用转化生... 详细信息

目的:本研究旨在探究土木香内酯(Alantolactone,ALA)通过介导lxrs-STAT3交叉对话改善硫代乙酰胺(TAA)诱导小鼠肝纤维化的作用机制,为肝纤维化的临床药物治疗提供有效的理论依据。方法:体外实验选用肝星状细胞(HSCs和LX-2),预先用转化生长因子(TGF-β)刺激细胞1h,采用不同浓度的ALA(1μM、5μM)处理4h,提取细胞总蛋白和RNA,检测细胞中lxrs、STAT3蛋白及mRNA的表达水平,以及采用免疫荧光染色进一步验证。并用Silxrβ和SiSTAT3试剂分别刺激HSCs和LX-2细胞,并提取细胞总蛋白和RNA,检测细胞中lxrs、STAT3蛋白及mRNA的表达水平,进一步验证lxrs-STAT3的交互作用。体内实验选用C57BL/6小鼠,所有小数随机分成6组,即正常组、TAA模型组、给药组每天灌胃给予土木香内酯10 mg/kg(低剂量组)、土木香内酯20mg/kg(高剂量)、阳性对照组灌胃给予姜黄素(Curcumin,Cur)20mg/kg,及土木香内酯(20mg/kg)单独给药组。正常组和土木香内酯单独给药组给予标准饮食,TAA模型及土木香内酯和姜黄素治疗组腹腔注射TAA(100或200mg/kg),建立肝纤维化模型。4周后,在末次灌胃给药6h后,处死小鼠并收集血清及肝脏组织,检测血清中ALT和AST的水平。并利用H&E染色、Masson染色、天狼猩红染色检测肝脏组织的病理变化。并通过蛋白印迹、PCR和免疫荧光检测肝脏组织中lxrs、STAT3等蛋白及mRNA的表达。结果:体外实验中,TGF-β可以诱导HSC激活并显著提高肝纤维化标记物的表达,而ALA可以显著降低活化的HSC细胞中肝纤维化标记物:α-SMA、Collagen-1、TIMP1的蛋白及mRNA表达,并显著抑制IL-1α、IL-1β、Caspase-1等炎症因子的释放。ALA可以激活细胞中lxrα、lxrβ的表达,抑制STAT3的磷酸化水平,进一步抑制JAK/STAT3信号通路,从而改善肝纤维化。并且通过SiRNA实验,验证了 lxrs-STAT3的交互作用。体内实验结果显示,ALA能够显著性降低TAA诱导的小鼠血清中ALT和AST的水平,并改善小鼠组织病理学上的变化。同时,ALA显著性抑制TAA诱导的小鼠肝纤维化标志物α-SMA、Collagen-I、TIMP1 的蛋白及 mRNA表达,并显著抑制了 IL-1α、IL-1β、Caspase-1等一系列炎症因子的释放和级联反应;ALA激活并上调了小鼠体内lxrα、lxrβ的蛋白及基因表达,并抑制STAT3的磷酸化,抑制JAK/STAT信号通路,改善肝纤维化。结论:土木香内酯可以显著降低肝纤维化标志物的表达,并有效抑制促炎因子的释放,可能通过介导lxrS-STAT3的交互作用改善肝纤维化。

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