Formononetin和C-3-G调控雌激素SULT代谢的作用及机制研究

作     者：刘范晔 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢松强;孙华

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：雌激素 磺酸基转移酶 LXRα RXRα 转录活性 

摘      要：实验目的:雌激素在体内有着重要的生理作用,雌激素水平紊乱将导致多种疾病的发生,磺酸基转移酶（Sulfotransferases,SULTs）介导的磺酸化代谢（SULT代谢）是机体清除雌激素的重要途径,因此明确影响雌激素SULT代谢的关键因素十分必要。酚性物质广泛存在于各种中药,具有多种药理活性,极具药物开发价值,因此探究其体内作用机制具有重要意义。本课题组及其他学者前期研究表明以芒柄花素（Formononetin,For）和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside,C-3-G）为代表的酚性物质是多种核受体激动剂,且具有调控II相代谢酶（如葡萄糖醛酸转移酶和磺酸基转移酶）的作用。因此本课题组有理由推测,富含酚性物质的中药可能通过作用于核受体,从而调控代谢酶活性及表达,影响内源性物质代谢,进而发挥药理作用。本文将阐明Formononetin和C-3-G调控SULTs酶及雌激素代谢的分子机制,为雌激素水平过高所导致的相关疾病治疗提供新思路和方向。实验方法:1、基于细胞模型（Hep G2和Huh-7细胞）,采用Real-time PCR（RT-PCR）法测定核受体LXRα和RXRα的m RNA的表达情况;采用Western blot（Wb）法测定LXRα、RXRα、SULT1E1和SULT1A1的蛋白表达情况。2、利用液相质谱鉴定雌二醇的磺酸化代谢物;从细胞水平探究Formononetin和C-3-G对SULTs酶表达及活性的调控作用:运用体外酶孵育法,利用细胞裂解液和重组酶,评价Formononetin和C-3-G对SULTs酶活性的影响;运用RT-PCR实验方法,评价Formononetin和C-3-G对SULTs酶m RNA的作用;运用Wb实验方法,评价Formononetin和C-3-G对LXRα、SULTs酶及其他雌激素代谢相关的调控因子【1型17β羟基甾体脱氢酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenases-1,17β-HSD1）和磺酸苷水解酶（Sulfatase,STS）】表达的影响;利用瞬时转染法,建立LXRα/RXRα过表达或敲低的细胞模型,评价Formononetin对SULTs酶的调控与LXRα/RXRα蛋白的依赖性。3、从动物水平探究Formononetin对SULTs酶的调控作用:连续4周以灌胃的方式给予小鼠不同浓度的Formononetin和LXRα激动剂,探究其对小鼠肝脏中SULTs酶、LXRα及其他雌激素代谢相关蛋白表达水平的影响;通过ELISA实验检测经药物处理后小鼠血清中雌激素水平的变化。4、探究Formononetin对SULTs酶调控的分子机制:通过Co-IP实验验证Formononetin对LXRα与RXRα异源二聚体的影响;运用双荧光素酶报告基因和Ch IP实验方法,解析LXRα/RXRα与SULTs酶启动子结合位点。实验结果:1、核受体LXRα和RXRα,SULT1E1和SULT1A1均在Hep G2和Huh-7细胞中表达。2、Hep G2和Huh-7细胞裂解液可催化雌二醇发生SULT代谢,Formononetin和C-3-G可促进雌二醇的SULT代谢并呈浓度依赖性。3、基于Hep G2和Huh-7细胞研究表明,Formononetin和C-3-G显著上调SULT1E1和SULT1A1的蛋白表达,并且下调STS和17β-HSD1的蛋白表达;此外,Formononetin和C-3-G可显著提高细胞中SULT1E1和SULT1A1的m RNA表达水平。4、动物水平:分析ELISA实验的数据,Formononetin和LXRα激动剂均可使小鼠血清中雌激素降低;Formononetin可以促进小鼠肝脏中LXRα、SULT1E1和SULT1A1的表达,并抑制STS和17β-HSD1的表达。5、Ch IP、Co-IP及荧光素酶报告基因实验结果表明,Formononetin可促进LXRα在SULT1E1和SULT1A1的启动子富集,并促进LXRα与RXRα异源二聚体的形成;Formononetin促进LXRα与SULT1E1启动子直接结合并激活其转录活性,其位点在-2198～-2217 bp基因序列中,而RXRα与SULT1A1启动子结合并激活其转录活性,其位点在-1620～-1610 bp基因序列中。实验结论:Formononetin和C-3-G可通过作用于LXRα/RXRα,增强SULT1E1和SULT1A1启动子转录活性,促进雌激素SULT代谢,进而降低体内雌激素水平。