检索结果-南通市图书馆

作者：孔静雅石河子大学

学位级别：硕士

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,lm)是一种胞内寄生的革兰氏阳性致病菌,能够引起动物和人类的脑膜炎、流产、败血症等疾病,死亡率能够达到20%-30%,对人类及畜牧业的生产有着重要的危害。研究证实众多的毒力因子与lm的毒... 详细信息

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,lm)是一种胞内寄生的革兰氏阳性致病菌,能够引起动物和人类的脑膜炎、流产、败血症等疾病,死亡率能够达到20%-30%,对人类及畜牧业的生产有着重要的危害。研究证实众多的毒力因子与lm的毒力有关,其中鞭毛不仅能介导lm的运动,还在lm对细胞的黏附、侵入和繁殖过程中发挥着重要作用。作者所在实验室从发生“转圈病”的绵羊大脑中分离到1株lm,命名为lm90sb并进行了大量相关研究,但编码鞭毛亚基的flaA基因对lm90sb毒力及生物被膜(BF)形成的影响还未见详细报道。本研究通过利用同源重组技术构建lm90sb的flaA基因缺失株,通过测定缺失株lm90sb-Δfla A的小鼠LD测定、细胞的黏附和侵染能力以及BF的形成等的影响,分析FlaA在lm90sb感染过程中的作用。主要研究内容及结果如下:***90sb的fla A基因缺失株的构建及其稳定性遗传本实验采用重叠PCR(SOE-PCR)方法得到融合片段ΔflaA,将其与pMD19-T连接后,经过酶切再与酶切后的穿梭质粒pKSV7连接得到p KSV7-ΔflaA,将重组质粒pKSV7-ΔflaA电转化进至lm90sb感受态细胞中,在氯霉素与温度的压力下进行同源重组。经过30代基因重组获得双交换基因缺失株后,转入无抗性培养基最终获得无抗性的基因缺失株。试验成功构建出具有良好遗传稳定性的lm90sb的fla A基因缺失株,并命名为lm90sb-ΔflaA。***90sb-Δfla A运动能力的测定及对小鼠毒力(LD)的影响研究采用半固体琼脂法测定细菌的运动性、菌落计数法计算小鼠脏器载菌量、改良寇氏法计算小鼠LD。与野毒株相比,lm90sb-ΔflaA的晕圈直径由1.38 cm下降到0.50 cm,运动能力下降了63.77%;与野毒株相比lm90sb-ΔflaA在感染小鼠肝脏中的载菌量降低,差异显著(p0.05);与野毒株相比,lm90sb-ΔflaA的LD值从4.27×10 cfu上升到了1.62×10 cfu,致病能力下降了3.8倍。结果表明FlaA显著影响lm90sb的运动性和毒力。***90sb-Δfla A黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7细胞的能力分析将MBMEC细胞和RAW264.7细胞培养成单层,分别按5:1和10:1的比例接种细菌。以lm90sb为对照,分别于细菌黏附MBMEC细胞、RAW264.7细胞1 h裂解细胞,通过倍比稀释涂板进行菌落计数;细菌分别侵染上述细胞2 h后裂解细胞倍比稀释涂板后进行菌落计数。结果显示lm90sb-ΔflaA对MBMEC细胞的黏附数(1.6×10 cfu)低于lm90sb的黏附数(2.8×10 cfu),差异显著(plm90sb(6.5×10 cfu),但差异并不显著(p>0.05)。lm90sb-ΔflaA对RAW264.7细胞的黏附数(5.0×10 cfu)和侵袭数(2.3×10 cfu)均低于lm90sb(8.9×10 cfu和3.3×10 cfu),差异显著(plm90sb对细胞黏附和侵袭能力。***对lm90sb生物被膜形成能力的影响将lm90sb与lm90sb-ΔflaA培养于96孔细胞培养板,分别于2、6、10、12、24、48 h时用结晶紫染色,荧光倒置显微镜下观察BF形成情况;采用乙醇-丙酮混合液溶解BF,测定OD定量测定BF的形成量;在含有盖玻片的6孔细胞培养板中培养细菌,用PI或刀豆蛋白A染色后,置于激光共聚焦显微镜下观察BF的形成情况。结果显示,光学显微镜下观察lm90sb-ΔflaA和lm90sb形成BF规律相似,即均在10 h左右形成较为完整的网状结构,但lm90sb-ΔflaA整体结构松散、致密性差。在37℃时,lm90sb-ΔflaA和lm90sb的BF形成的OD值规律大致相同,均在10 h左右进入稳定期,但整个过程lm90sb-Δfla A形成BF量均偏少,差异显著(p25℃时,lm90sb-ΔflaA的BF形成规律与lm90sb大致相同,但形成过程中每个时间点lm90sb-ΔflaA BF量下降明显,且差异极显著(plm90sb-ΔflaA的BF结构中核酸与多糖的分布松散、稀疏、散点状分布。表明FlaA在lm90sb的BF形成过程中起到重要的促进作用,且温度对缺失株BF的形成有明显影响。本研究通过同源重组方法构建了flaA基因缺失株lm90sb-ΔflaA,并研究了flaA基因缺失对lm90sb毒力、及BF形成能力等的

关键词： lm90sb2 flaA基因毒力细胞黏附细胞侵袭生物被膜

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变溶菌素(Mutanolysin)酶解单核细胞增多性李斯特菌细胞壁条件的优化

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石河子大学学报（自然科学版） 2016年第4期34卷 436-439页

作者：丁剑曹树珠陈朔马勋石河子大学动物科技学院预防兽医学重点实验室新疆石河子832003

为了最大效率提取单核细胞增多性李斯特菌LB90sb2细胞壁表面蛋白,本研究对变溶菌素浓度和酶解时间进行了优化。选择20、60μg/m L的变溶菌素浓度进行30 min-4 h,37℃酶解以及37和4℃低温联合酶解,通过测定酶解前后OD600和CFU,判断细胞... 详细信息

为了最大效率提取单核细胞增多性李斯特菌LB90sb2细胞壁表面蛋白,本研究对变溶菌素浓度和酶解时间进行了优化。选择20、60μg/m L的变溶菌素浓度进行30 min-4 h,37℃酶解以及37和4℃低温联合酶解,通过测定酶解前后OD600和CFU,判断细胞膜完整性和计算原生质体形成率,筛选最佳酶解浓度和酶解时间。在最佳酶浓度的条件下,测定不同酶解时间细胞壁蛋白提取物浓度。结果表明:在酶解30 min-4 h,原生质体形成率从0提高至91.00%,细胞壁蛋白浓度从0.272增加至1.735 mg/m L。△OD600在1.86%-14.50%变动,但△OD600的统计学处理差异不显著。60μg/m L变溶菌素作用4 h的原生质体形成率达到91.00%,远高于20μg/m L变溶菌素作用4 h的78%。最终确定变溶菌素浓度为60μg/m L,酶解时间4 h为酶解lm90sb2细胞壁的最佳条件。本研究为下一步研究细胞壁表面蛋白奠定基础。

关键词： lm90sb2 原生质体制备变溶菌素

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