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细胞与分子免疫学杂志 2003年第5期19卷 499-502页

作者：黄钢白云姜曼黎万玲第三军医大学分子遗传学教研室重庆400038 第三军医大学免疫学教研室重庆400038

目的 :构建人light fc基因的真核表达质粒 ,并表达获得有较高生物学活性的纯化人light fc融合蛋白。方法 :从cDNA文库中PCR扩增light全长编码基因 ,并导入克隆载体。测序证实后 ,继续用PCR扩增其膜外区cDNA ,用重叠延伸技术(SOE)引入CD... 详细信息

目的 :构建人light fc基因的真核表达质粒 ,并表达获得有较高生物学活性的纯化人light fc融合蛋白。方法 :从cDNA文库中PCR扩增light全长编码基因 ,并导入克隆载体。测序证实后 ,继续用PCR扩增其膜外区cDNA ,用重叠延伸技术(SOE)引入CD137信号肽基因。将SOE产物与hIgG1fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中 ,瞬时转染 2 93T细胞 ,用夹心ELISA检测其表达情况 ,经蛋白A亲和纯化 ,用SDS PAGE检测其纯度与Mr,并以肿瘤细胞为靶细胞 ,检测其生物学活性。结果 :测序证实构建的light与light fccDNA阅读框完整 ,连接部位序列正确 ;ELISA和SDS PAGE证实light fc融合蛋白的表达与纯度 ;MTT证明人light fc蛋白对一些肿瘤细胞系具有生长抑制作用。结论 :获得了有抗肿瘤活性的纯化hlight fc融合蛋白 ,为探讨light在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制。

关键词：人 light light-fc 信号肽重叠延伸蛋白A亲和层析抗肿瘤生物学活性

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人light-fc的构建、表达及其抗肿瘤与共刺激活性的初步研究

人LIGHT-Fc的构建、表达及其抗肿瘤与共刺激活性的初步研究

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作者：黄钢第三军医大学

学位级别：硕士

light是一个新发现的TNF超家族成员，又名TNFSF-14或HVEM-L，为一29kD的II型跨膜糖蛋白，多以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞和选择性表达于未成熟树突状细胞上，是一个多功能多效应分子，根据靶细胞上表达的受体与T细胞所分泌的细... 详细信息

light是一个新发现的TNF超家族成员，又名TNFSF-14或HVEM-L，为一29kD的II型跨膜糖蛋白，多以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞和选择性表达于未成熟树突状细胞上，是一个多功能多效应分子，根据靶细胞上表达的受体与T细胞所分泌的细胞因子的不同而启动不同的生物学效应。目前发现light有三个受体：HVEM/TR2、LTβR和TR6/DcR3，均为TNFR超家族成员。其中HVEM/TR2组成性表达在未致敏T细胞表面，且在T细胞活化后表达水平有所下调;而LTβR只表达于基质细胞等非淋巴细胞以及一些肿瘤细胞的表面;TR6/DcR3则是缺乏跨膜区的一种可溶性的FasL诱饵受体，主要由胃、脊髓、结肠、淋巴结和脾脏以及肺和结肠来源的肿瘤细胞表达，而外周血淋巴细胞不表达。light-HVEM相互作用为T细胞的活化提供一个非CD28依赖性的共刺激信号，参与激活特异性CTL反应并诱导以IFN-γ和GM-CSF为代表的Th1型细胞因子分泌;light-LTβR相互作用通过接头蛋白TRAF激活死亡信号通路诱导肿瘤细胞的凋亡;TR6则作为可溶性诱饵受体通过竞争light配体，干扰或阻断light-HVEM及light-LTβR所引发的生物学效应，从而对免疫应答和免疫自稳进行调节，并可作为肿瘤的免疫逃逸手段之一发挥作用。现有研究发现light在淋巴器官的发生、肿瘤免疫、自身免疫病、移植排斥反应和抗病毒免疫中均发挥重要的作用。因为light兼具共刺激和细胞毒两方面的活性，有强大的抗肿瘤潜力，所以它很快成为免疫学研究的热点分子之一。为了深入探讨light的抗肿瘤机制及其它生物学功能，本研究拟克隆、构建并表达获得具有生物学活性的可溶性light-fc蛋白分子，其意义在于：一方面，可溶性的 light-fc结合受体后，在体内即可发挥诱导肿瘤细胞凋亡及对T细胞的共刺激活性，进而用于肿瘤免疫治疗，当条件成熟时，可被开发成一种治疗肿瘤的生物制剂;在另一方面，获得纯化的可溶性light-fc蛋白，为进一步探讨light在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制以及探索light的其它生物学功能奠定了坚实的基础。本研究主要进行了以下三部分的工作： 1. 人light全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及light-fc的真核表达载体的构建。 ⑴ 采用PCR技术，从来自活化正常人T细胞的cDNA文库***扩增出编码人light全长240aa的cDNA序列，装入克隆载体后，经Amp抗性和蓝白斑筛选获得阳性重组子后，经测序证实同公布的lightcDNA序列基本一致，编码氨基酸完全一致;⑵ 将全长light的cDNA片段从克隆载体上用EcoRI切下来，装入EcoRI线性化的真核表达载体pCI-neo和pcDNA3中，酶切鉴定出正向插入的阳性重组子，为从细胞水平研究light的功能奠定了基础;⑶ 应用SOE技术构建了带外源信号肽的重组light融合分子，并与hIgG1fc一起装入真核表达载体pCI-neo和pcDNA3中，测序证实成功构建了light-fc的真核表达载体，为进一步获得light-fc融合蛋白打下了基础。 2. light-fc蛋白的表达，纯化。 ⑴ 用脂质体法瞬时转染哺乳动物细胞，夹心ELISA证实有融合蛋白的表达;⑵ 蛋白A亲和层析纯化light-fc蛋白，并用SDS-PAGE初步确定其单体的分子量和纯度。 3. 纯化light-fc蛋白的生物学活性研究。 ⑴ 以A375，MCF-7，Hela和A549细胞为靶细胞，MTT法检测发现light-fc蛋白对前三者有直接的生长抑制效应，而A549可能由于表达可溶性诱饵受体TR6，封闭了light对A549的直接细胞毒效应，从而发生免疫逃逸。总之，初步证实了light-fc蛋白对肿瘤细胞的细胞毒效应。 ⑵ 夹心ELISA法检测了light-fc蛋白对纯化人外周T淋巴细胞的共刺激效应，并能诱导IFN-γ等Th1型细胞因子的分泌。

关键词：人light PCR light-fc 信号肽重叠延伸真核表达蛋白A亲和层析抗肿瘤细胞毒共刺激

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light-fc基因转染上调食管癌细胞ICAM-1的表达

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重庆医学 2004年第12期33卷 1800-1801页

作者：熊刚杨康白云第三军医大学西南医院胸心外科重庆400038 第三军医大学基础医学部分子遗传教研室重庆400038

目的　探讨light对人食管癌细胞的体外抑制效应的可能机制。方法　以DOTAP脂质体介导light fc基因转染人食管癌细胞株Eca10 9,通过免疫组织化学及流式细胞仪检测来观察light fc转染对Eca10 9细胞上ICAM 1表达水平的影响。结果　Eca10 9... 详细信息

目的　探讨light对人食管癌细胞的体外抑制效应的可能机制。方法　以DOTAP脂质体介导light fc基因转染人食管癌细胞株Eca10 9,通过免疫组织化学及流式细胞仪检测来观察light fc转染对Eca10 9细胞上ICAM 1表达水平的影响。结果　Eca10 9细胞表达light fc基因上调了细胞表面ICAM 1的表达水平。结论　light fc基因转染上调人食管癌细胞株上ICAM 1的表达可能是其体外抑瘤效应的一种机制 ,但全面评价有待进一步的研究。

关键词： light-fc 转染 Eca109细胞 ICAM-1

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