检索结果-南通市图书馆

作者：马阳河北医科大学

学位级别：硕士

目的:本论文分为两大部分,第一部分从基础细胞实验层面研究肺腺癌A549细胞中EGFR表达量与自噬活性的关系;第二部分从临床实验角度研究,肺腺癌患者胸水中癌细胞EGFR突变状态与自噬活性是否相关。下面分别阐述:(一)研究显示肺癌为全世界... 详细信息

目的:本论文分为两大部分,第一部分从基础细胞实验层面研究肺腺癌A549细胞中EGFR表达量与自噬活性的关系;第二部分从临床实验角度研究,肺腺癌患者胸水中癌细胞EGFR突变状态与自噬活性是否相关。下面分别阐述:(一)研究显示肺癌为全世界范围内发病率和死亡率极高的癌症,通过特异性RNA干扰介导技术降低表皮生长因子受体EGFR的表达,来探究EGFR对肺腺癌A549细胞的自噬活性的影响,为肺癌实验及临床研究提供新的思路。(二)随着对肺癌发生、发展中分子生物学机制、诊断和预后以及肺癌中癌基因突变的深入研究,目前辅助EGFR靶向治疗的新型诊断方法已成为现阶段研究的热点,在此我们运用Real Time RT-PCR方法检测肺腺癌患者胸水细胞,比较EGFR突变组与非突变组的自噬相关基因lc3和Beclin1的表达是否有差异,探索自噬活性与EGFR突变状态是否相关,为临床及实验研究提供新的思路和突破点。方法:(一)1应用基因转染技术,将EGFR特异性干扰RNA转染入肺腺癌A549细胞中,应用Real Time RT-PCR(real time reverse transcription polymerase chain reaction)、Western-Blot方法检测外源性EGFR特异性干扰RNA(EGFR si RNA)介导的表皮生长因子EGFR转录后的基因沉默效应。2选取处于对数生长期的肺腺癌A549细胞,将其接种于六孔板内,本实验可分为四组:转染EGFR si RNA组、转染negative control si RNA组、转染试剂组和正常组。经si RNA转染后,分组细胞皆经适量浓度EGF处理半个小时后,应用Westrn-Blot方法检测EGFR si RNA转录A549细胞前后自噬效应分子lc3蛋白表达水平的变化,并分析其与表皮生长因子受体EGFR之间相互作用的关系。3用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)对比观察转染EGFR特异性干扰RNA(EGFR si RNA)组和阴性对照组si RNA(control si RNA)组自噬小体的变化,判断细胞内自噬情况。(二)收集河北医科大学第四医院癌检中心2015年9月至2015年12月初诊疑似肺癌患者胸水。1苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE染色法)对患者胸水细胞涂片进行诊断筛查。2免疫细胞化学法(Immunochemistry,ICC)进一步诊断细胞涂片上癌细胞的类型。3 ARMS(amplification refractory mutation system)实时定量荧光PCR法扩增癌细胞检测EGFR基因是否突变,进而把患者分为EGFR突变组与EGFR非突变组。4 Real Time RT-PCR方法检测胸水中癌细胞中自噬效应分子lc3和Beclin1的m RNA水平,运用统计学方法比较EGFR基因突变组与EGFR非突变组自噬效应分子lc3与Beclin1是否有差异性。结果:(一)1 Western-Blot实验结果显示,在转染EGFR特异性干扰RNA的A549细胞中,转染EGFR特异性si RNA(1,3)后,表皮生长因子EGFR的蛋白水平上表达量均有明显降低,具有统计学差异(Plc3-ⅱ/lc3-ⅰ比值显著增加。3透射电子显微镜对比观察转染EGFR特异性si RNA(EGFR si RNA)组和阴性对照si RNA(control si RNA)组,结果显示EGFRsi RNA组细胞中形成较多大量双层膜包裹未被完全降解的细胞内容物的自噬小体。(二)1 HE常规染色涂片分别经两位细胞病理学医生初诊,均可见丰富的恶性肿瘤细胞,细胞呈多形型,细胞核增大,染色质粗糙,核浆比增大,即可满足进一步免疫细胞化学染色与ARMS法检测的需要。2免疫细胞化学染色法中,肺腺癌特异性标记抗体TTF-1及Napsin A等在细胞学涂片中都表现为阳性,即通过免疫细胞化学染色进一步诊断患者胸水属于肺腺癌。3 ARMS法检测恶性胸水共计40例,其中检测出EGFR非突变组15例,突变组25例。4 Real Time RT-PCR检测突变组与非突变组中的自噬相关蛋白lc3在统计学上有显著差异性,而Beclin1在统计学上无显著差异性。结论:1特异性EGFR si R

关键词： EGFR 自噬 EGFR siRNA 胸水 lc3-ⅱ/lc3-ⅰ Beclin1

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血卟啉注射液介导的光动力疗法诱导小鼠乳腺癌4T1细胞自噬的初步研究

血卟啉注射液介导的光动力疗法诱导小鼠乳腺癌4T1细胞自噬的初步...

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作者：赵逸冰锦州医科大学

学位级别：硕士

目的通过设计体内外的实验模型,借助光动力的杀伤原理来探索血卟啉注射液喜泊分(HpD)介导的光动力(PDT)治疗4T1小鼠乳腺癌细胞后,发生的原位细胞的死亡效应及其自噬反应。借助细胞部分以及荷瘤小鼠两部分的研究内容,对比在体、离体情况... 详细信息

目的通过设计体内外的实验模型,借助光动力的杀伤原理来探索血卟啉注射液喜泊分(HpD)介导的光动力(PDT)治疗4T1小鼠乳腺癌细胞后,发生的原位细胞的死亡效应及其自噬反应。借助细胞部分以及荷瘤小鼠两部分的研究内容,对比在体、离体情况下,光动力引发肿瘤细胞的杀伤、自噬的强弱,对自噬关键基因Beclin-1、lc3以及关键蛋白Beclin-1、lc3、P62的检测,确定自噬发生的时间以及程度,并借助设计不同能量的实验组来进一步探索光动力剂量与自噬强弱及自噬出现时间的关系。方法一、培养4T1小鼠乳腺癌细胞,设计实验分组,通过CCK8实验证明单纯添加光敏剂及单纯630nm激光照射的单因素组与空白对照组的实验结果,彼此之间无统计学差异。光敏剂喜泊分(HpD)浓度选择为1.5ug/ml,结合文献报道以及前期实验摸索,照光的功率密度为10mw/cm,实验分组设置为:空白对照组、光敏剂加照光(1J/cm)、光敏剂加照光组(4J/cm)。来观测肿瘤细胞死亡率与能量之间的关系,进一步使用60mm的培养皿进行细胞的分组处理后,分别在3h、6h、12h进行收集细胞,使用RT-PCR检测自噬相关基因,Western Blot检测自噬相关蛋白,来分析自噬出现的时间、程度以及与光动力治疗剂量的关系。二、建立Balb/c小鼠乳腺癌模型,设计实验分组,浓度为8×10个/ml的4T1乳腺癌细胞悬液来进行荷瘤小鼠模型的构建。模型构建成功后进行实验分组,分为空白对照组、40J/cm、100J/cm三组,保证肿瘤原始大小组间无差异,实验组的小鼠尾静脉注射100u l浓度为1mg/ml的HpD,对照组不作处理,光敏剂在体48h后进行照光处理,固定功率密度为100mw/cm,照光时间分别为400s和1000s。处理后的小鼠进行生存曲线以及生长曲线的绘制。采取同样的建模方式,在12h、24h、48h对各组小鼠进行取材,将取出的肿瘤组织制成石蜡切片,进行HE染色,显微镜下观察不同组之间肿瘤细胞的形态学差异,TUNEL染色观察肿瘤细胞的凋亡水平。三、建立Balb/c小鼠乳腺癌模型,方法同前,然后通过使用RT-PCR检测自噬相关基因,Western Blot检测自噬相关蛋白,借助数据分析软件来定量分析自噬与光动力治疗剂量之间的关系。结果1、在细胞水平,Beclin-1在4J/cm组在3h与6h相对于同时间段的对照组的具有统计学的差异,1J/cm在12h相高于6h,并且有统计学的差异,lc3-ⅱ/lc3-ⅰ在1J/cm与4J/cm组内从3h均有升高,并且升高的趋势和能量密度正相关,实验组在6h与对照组相比对照组lc3-ⅱ/lc3-ⅰ依然升高并且都具有显著的统计学差异,随后到12h实验组均低于对照组,而在组内可以看出1J/cm在整个时间段里的表现是3h到6h升高,6h到12h降低,而4J/cm组则是在3h就表现出明显的升高,随后逐渐降低。2、40J/cm的原位的直接杀伤作用不如100J/cm但是远期的抑瘤效果更优,免疫组化等结果显示原位杀伤作用和能量密度呈正相关,并且出现的时间也有相关性。3、自噬的相关基因100J/cm组的Beclin-1在12h高于对照组,并且随后出现下降的趋势,而40J/cm组则在24h高于对照组,随后也出现下降趋势,能量密度高引发自噬的时间越早,而lc3的表达相对更晚,蛋白Beclin-1在40J/cm组12h的表达水平明显高于对照组并且随着时间而逐渐减低,100J/cm的表达情况也类似。lc3-ⅱ/lc3-ⅰ的整体表达情况更能反映自噬的强弱,40J/cm组在12h已经出现自噬反应,在24h自噬水平升高后到48小时降低,而100J/cm组则在12h后呈现逐渐降低,在100J/cm自噬被激发的时间更早,作用效果更强。结论不同能量密度对肿瘤细胞的杀伤作用存在差异,细胞的死亡比例随能量密度的升高而升高,PDT激发了细胞的自噬,自噬相关基因的表达增强,关键蛋白的表达量增加,促进自噬小体的生成,完成自噬,而不同的能量刺激下,自噬的程度有所差异。4J/cm组中lc3-ⅱ/lc3-ⅰ的值,在3h表现出升高的趋势,并在6h上升,12h下降。1J/cm组中肿瘤细胞的自噬在6h表现高峰。自噬升高的趋势以及发生时间和能量密度相关。荷瘤小鼠模型中PDT对原位肿瘤的杀伤作用随着能量的增加而增强,但是从长期的抑瘤作用以及荷瘤小鼠生存时间来看,40J/cm组可能因为诱发了免疫反应要优于100J/cm组,免疫组化以及TUNEL的结果也可以看出杀伤作用和能量呈正相关,100J/cm组要早于40J/cm组;从自噬相关基因的表达倍增来看,100J/cm组要早于40J/cm组;结合关键蛋白lc3-ⅱ/lc3-ⅰ的变达情况,PDT治疗后肿瘤组织内的自噬在12h升高24h达到相应的峰值后出现下降的趋势。

关键词：自噬光动力 4T1细胞杀伤作用 lc3-ⅱ/lc3-ⅰ

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沉默表皮生长因子受体的表达对肺腺癌A549细胞自噬的影响

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癌变．畸变．突变 2019年第5期31卷 347-351,358页

作者：马阳吴娟纪晓坤王蕊杜芸王珩郭晓张艳河北医科大学第四医院癌检中心

目的:研究降低表皮生长因子受体(EGFR)的表达对肺腺癌A549细胞自噬活性的影响.方法:A549细胞中加入EGF处理,分为4组,即未处理组和10、25、50 ng/mL EGF处理组,用Western blot方法检测EGFR的蛋白表达;采用转染siRNA降低肺腺癌细胞A549细... 详细信息

目的:研究降低表皮生长因子受体(EGFR)的表达对肺腺癌A549细胞自噬活性的影响.方法:A549细胞中加入EGF处理,分为4组,即未处理组和10、25、50 ng/mL EGF处理组,用Western blot方法检测EGFR的蛋白表达;采用转染siRNA降低肺腺癌细胞A549细胞EGFR的表达,将A549细胞分为4组,即未处理组、EGFR siRNA-1组、EGFR siRNA-2组和EGFR siRNA-3组,分别采用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测EGFR mRNA和蛋白表达水平来评价3个siRNA的沉默效果;将A549细胞分为转染EGFR siRNA组、转染空载体组、转染试剂组(只加入等量转染试剂)及未处理组,且4组均加入等量的50 ng/mL EGF,用Western blot检测lc3Ⅱ/lc3Ⅰ蛋白表达,观察沉默EGFR表达对自噬活性变化;A549细胞分为转染EGFR siRNA组和转染空载体组,用透射电子显微镜观察自噬小体.结果:转染siRNA后A549细胞EGF蛋白的表达降低,lc3Ⅰ向lc3Ⅱ的转化水平升高(P<0.05),细胞内出现较多自噬小体,自噬活性明显增加.结论:降低EGFR的表达可以提高肺腺癌A549细胞自噬活性.

关键词：表皮生长因子受体肺腺癌自噬 siRNA lc3-ⅱ/lc3-ⅰ

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三叶青黄酮对食管鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭及自噬的影响

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福建中医药 2023年第4期54卷 17-20,32页

作者：殷晓庆涂铭书庄婉珍夏雨张毅黄毅福建中医药大学中西医结合学院福建福州350122 福建省立医院福建福州350001

目的探讨三叶青黄酮对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞迁移、侵袭及自噬的影响。方法取对数生长期的人ESCC细胞株KYSE150细胞(以下简称KYSE150细胞)分为0μg/mL组、25μg/mL组、50μg/mL组、75μg/mL组,采用CCK-8法检测三叶青黄酮溶液干预0... 详细信息

目的探讨三叶青黄酮对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞迁移、侵袭及自噬的影响。方法取对数生长期的人ESCC细胞株KYSE150细胞(以下简称KYSE150细胞)分为0μg/mL组、25μg/mL组、50μg/mL组、75μg/mL组,采用CCK-8法检测三叶青黄酮溶液干预0、24、48 h后各组细胞活力并计算干预48 h的半抑制浓度(IC_(50)),筛选出三叶青黄酮溶液最佳干预浓度为50μg/mL。取对数生长期的KYSE150细胞分为0μg/mL组、50μg/mL组,采用Transwell小室法检测三叶青黄酮溶液干预48 h后2组细胞迁移、侵袭能力,Western blot检测上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白N-cadherin、Snail、Slug蛋白表达量。取对数生长期的KYSE150细胞分为空白组、氯喹组、三叶青黄酮组、三叶青黄酮+氯喹组,空白组不使用药物干预,氯喹组加入10μmol/L氯喹,三叶青黄酮组加入50μg/mL三叶青黄酮溶液,三叶青黄酮+氯喹组加入10μmol/L氯喹与50μg/mL三叶青黄酮溶液干预,均干预48 h后采用Western blot检测自噬相关蛋白lc3-ⅱ/lc3-ⅰ、p62蛋白表达量。结果与0μg/mL组比较,各药物组随着三叶青黄酮溶液浓度的增加,KYSE150细胞活力均逐渐下降(P均lc3-ⅱ/lc3-ⅰ、p62蛋白表达量均显著增高(P均lc3-ⅱ/lc3-ⅰ、p62蛋白表达量增高更显著(Plc3-ⅱ/lc3-ⅰ与p62的表达诱导自噬体的产生,从而抑制细胞自噬流,发挥对ESCC细胞活力的抑制作用。

关键词：三叶青黄酮自噬细胞迁移侵袭 lc3-ⅱ/lc3-ⅰ p62

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