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lamp2a改善帕金森病恒河猴模型的运动功能及其作用机制

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LAMP2A改善帕金森病恒河猴模型的运动功能及其作用机制

作者：朱旭超北京协和医学院

学位级别：硕士

背景:散发性帕金森病(sporadic Parkinson’s disease,sPD)的发病机制未明(以下统称为PD),尚无有效的根治措施。PD的主要病理学表现为α-syn及其聚集体如路易小体(Lewybodies,LBs)在脑内的沉积。近些年的研究发现α-syn/LBs具有朊蛋白... 详细信息

背景:散发性帕金森病(sporadic Parkinson’s disease,sPD)的发病机制未明(以下统称为PD),尚无有效的根治措施。PD的主要病理学表现为α-syn及其聚集体如路易小体(Lewybodies,LBs)在脑内的沉积。近些年的研究发现α-syn/LBs具有朊蛋白样特性,在PD的发病中起着不可忽视的作用。同时,PD病人与啮齿类动物模型出现分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)的异常,其中CMA的关键分子lamp2a表达下降。我们前期在大鼠模型研究结果也提示lamp2a表达降低可能通过减少α-syn的CMA自噬途径,增加α-syn的沉积和聚集,从而参与PD的发病。为进一步验证上述假设并探讨lamp2a在PD中的作用机制,我们通过构建人源性PD的恒河猴动物模型和PFF诱导的SH-SY5Y细胞模型,通过运动行为学,分子生物学等方法研究过表达lamp2a对PD潜在治疗作用的初步机制,以期为PD的发病机制和治疗提供线索。方法:1.应用立体定位注射仪向7只恒河猴的右脑纹状体区注射sPD患者死亡后脑组织(荷兰脑库)的路易小体(Lewy bodies,LBs)提取物,同时在左脑纹状体区注射非PD病人死亡后的脑组织(荷兰脑库)提取物来构建PD恒河猴模型;2.模型动物随机分为两组,lamp2a过表达组(n=4)在其黑质区双侧注射过表达lamp2a的腺相关病毒载体;模型组(n=3)在黑质区双侧注射对照病毒载体;3.通过取物实验、旷场、阶梯实验、平板取食实验评价PD恒河猴模型运动能力和lamp2a对该PD模型运动功能的影响;4.利用ELISA法对PD恒河猴模型脑脊液、血清的总α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)及磷酸化α-syn(Ser129)水平进行测定;5.构建PD细胞模型和分组:利用超声处理后的α-syn前体原纤维(PFF)与SH-SY5Y共孵育48h,PFF终浓度为2μg/μL,确定建模方法和条件;利用慢病毒构建lamp2a过表达、lamp2a低表达、lamp2a空载体细胞系,并以PFF的处理与否,设置6个细胞实验分组;6.利用RT-PCR检测lamp2a转录;荧光显微镜检测慢病毒转染效率;Western Blot检测lamp2a、磷酸化α-syn、RILP的表达情况;丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞氧化应激指标;活细胞溶酶体染色标记细胞内溶酶体数量。结果:1.过表达lamp2恒河猴与模型组的认知能力和一般运动水平没有显著变化;2.lamp2a过表达组在精细运动实验中上肢抓取效率高于模型组;3.ELISA测定模型组术后12月脑脊液、血清的总α-syn水平及磷酸化α-syn水平显著增高;lamp2a过表达组PD恒河猴模型的脑脊液、血清磷酸化的α-syn水平在术后第8月起均低于同期模型组;4.过表达lamp2a降低了 SH-SY5Y细胞的氧化应激水平;5.过表达lamp2a增加细胞CMA活性以及SH-SY5Y细胞内溶酶体的生成、转运提高了磷酸化α-syn的清除效率。结论:过表达lamp2a通过增加α-syn的CMA清除从而改善了 PD恒河猴模型精细运动能力。体外实验也表明过表达lamp2a可以降低PD细胞模型的氧化应激水平、增加了细胞的溶酶体生成和转运。本研究为进一步研究PD的发病机制和治疗提供了参考,同时也为非人灵长类动物模型的行为学研究提供了方法依据。

关键词： lamp2a 帕金森病 CMA 行为学 SH-SY5Y

lamp2a和MEF2D在增龄过程中大鼠髓核组织的表达及其意义

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中华实验外科杂志 2010年第11期27卷 1615-1617页

作者：叶伟梁安靖彭焰朱伟荣陈晋宸李春海黄东生中山大学孙逸仙纪念医院脊柱外科广州510120

目的探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中lamp2a和MEF2D的表达及其意义.方法 3、12、24月龄SD大鼠各8只,建立青年大鼠组、中年大鼠组和老龄大鼠组模型,透射电镜检测髓核细胞中自噬体的表达逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot... 详细信息

目的探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中lamp2a和MEF2D的表达及其意义.方法 3、12、24月龄SD大鼠各8只,建立青年大鼠组、中年大鼠组和老龄大鼠组模型,透射电镜检测髓核细胞中自噬体的表达逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法测定髓核组织中lamp2a和MEF2D的表达.结果不同年龄组大鼠髓核细胞中均有自噬体的表达 RT-PCR和Western blot法显示lamp2a在3、12、24月龄组中均有表达（0.91±0.07、1.12±0.11、1.32±0.28和0.45±0.06、0.55±0.08、0.63±0.11）,且在老龄组表达较青年组表达明显增高（P＜0.01和P＜0.05）,在3、12、24月龄组中,RT-PCR和Western blot法亦显示MEF2D均有表达（0.66±0.10、0.55±0.08、0.52±0.08和0.46±0.03、0.43±0.02、0.41±0.04）,且24月龄组表达明显较青年组低（P均＜0.01）.结论自噬存在于椎间盘退变过程中分子伴侣介导的自噬活性的增加可能与椎间盘退变的发展进程有关.lamp2a介导的分子伴侣自噬性细胞死亡可能通过MEF2D进行调节.

关键词：椎间盘退变增龄分子伴侣介导的自噬 lamp2a MEF2D

lamp2a对食管鳞状细胞癌发生发展及顺铂敏感性的影响

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LAMP2A对食管鳞状细胞癌发生发展及顺铂敏感性的影响

作者：单丹阳郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的食管癌是常见的恶性肿瘤之一。在中国食管鳞状细胞癌约占食管癌总数的90%,它发病率高,预后差,普遍化疗耐药,死亡率高,目前临床尚缺乏有效的治疗方法,因此急需更深入的了解它的发病机理,开发新的治疗方法。溶酶体相关膜糖蛋白 ... 详细信息

背景和目的食管癌是常见的恶性肿瘤之一。在中国食管鳞状细胞癌约占食管癌总数的90%,它发病率高,预后差,普遍化疗耐药,死亡率高,目前临床尚缺乏有效的治疗方法,因此急需更深入的了解它的发病机理,开发新的治疗方法。溶酶体相关膜糖蛋白 2A(Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 iso form A precursor,LMAP2A),是分子伴侣介导的自噬作用中的关键蛋白之一,已有文献报道该蛋白参与多种肿瘤的形成和发展,但它在食管鳞状细胞癌中的作用尚不清楚。本文旨在研究lamp2a对食管鳞癌细胞增殖,迁移和对顺铂敏感性的影响,通过体外功能实验研究lamp2a在食管鳞癌发生发展中的作用,为食管鳞状细胞癌的靶向治疗提供新的思路。方法本研究首先用生物信息学方法分析溶酶体相关膜糖蛋白2在TCGA数据库和GTEx数据库中的食管癌样本中的表达情况。然后利用二代慢病毒包装系统(三质粒系统)建立lamp2a敲低或者过表达的食管鳞癌细胞株,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞,然后采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法(Western Blotting)分别在mRNA水平和蛋白水平鉴定lamp2a的表达情况。其次,体外培养改造后的食管鳞癌细胞株,并探究lamp2a对细胞增殖,迁移和克隆形成能力等恶性性状的影响。使用IncuCyte Zoom动态监测细胞增殖情况,划痕实验检测lamp2a对细胞迁移能力的影响。平板克隆形成实验检测lamp2a对细胞克隆形成能力的影响。同时,本研究还用顺铂处理改造后的食管鳞癌细胞,并用MTS法检测细胞活力,确定lamp2a在食管鳞癌细胞对化疗药敏感性中的作用。结果1.GEPIA在线软件分析TCGA数据库和GTEx数据库中食管癌组织样本和对应的正常食管组织样本的结果表明,lamp2在癌组织中的表达高于其在正常组织中的表达,而且高表达lamp2的患者生存期更短。2.实时荧光定量PCR和Western Blotting的结果表明,用pLKO-shlamp2a(敲低lamp2a的慢病毒)感染KYSE150和KYSE510细胞后,lamp2a在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低;用FUB-lamp2a(过表达lamp2a的慢病毒)感染KYSE410细胞和KYSE180细胞后,lamp2a在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著升高,表达绿色荧光蛋白的细胞达到细胞总数的90%以上,即成功地构建了稳转细胞株。3.IncuCyte Zoom动态监测,划痕实验以及平板克隆形成实验的结果显示,敲低lamp2a能够抑制KYSE150和KYSE510细胞的增殖,迁移和克隆形成能力;过表达lamp2a促进KYSE410和KYSE180细胞的增殖和克隆形成能力,但仅提高了 KYSE180细胞的迁移能力,对KYSE410的迁移能力无明显影响。4.敲低lamp2a提高KYSE150和KYSE510细胞对顺铂的敏感性;但过表达lamp2a的KYSE410和KYSE180细胞对顺铂的敏感性无明显变化。结论1.lamp2a促进食管鳞癌细胞的增殖,迁移与克隆形成。2.敲低lamp2a可提高食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性。

关键词： lamp2a 食管鳞癌增殖迁移顺铂

lamp2a在炎症性肠病中的作用和机制研究

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LAMP2A在炎症性肠病中的作用和机制研究

作者：王炜杰中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

背景炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一组肠道非特异性炎症疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。目前,IBD的具体发病机制尚未明确,但是普遍认为IBD发病是由多种因素相互作用... 详细信息

背景炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一组肠道非特异性炎症疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。目前,IBD的具体发病机制尚未明确,但是普遍认为IBD发病是由多种因素相互作用共同导致,其中遗传易感者在环境的刺激下,引起的肠道内菌群失调,肠道内固有免疫和适应性免疫紊乱,从而最终引起肠黏膜损伤。在我国,IBD的发病率和患病率近年来一直呈上升态势,相关的文献报道和病例数目也逐渐增多。自噬(autophagy)是一种维持细胞正常活动的胞内吞噬现象。组织细胞通过吞噬自身细胞质蛋白,以及受损细胞器等内容物,并最终在溶酶体中分解成为氨基酸、核糖等代谢物,从而维持实现细胞的正常代谢以及稳态。目前已经研究发现的自噬方式共有三种:大自噬(macroautophagy),小自噬(microautophagy),分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。CMA仅存在哺乳动物细胞内,具有一定的选择性,主要是通过热休克蛋白70识别含有KFERQ序列的蛋白后形成复合体定位到溶酶体,通过溶酶体相关膜蛋白2A(lysosome-associated membrane protein2A,lamp2a)转运穿过溶酶体,最终被胞内水解。lamp2a作为CMA的限速分子,其表达或功能异常必定会影响疾病的发生、发展。在大量关于自噬和免疫的研究中,发现自噬不仅参与了大量固有免疫而且也参与了适应性免疫应答,而IBD发病的一个重要环节就是肠道内固有免疫和适应性免疫的紊乱,因此通过调节lamp2a的表达从而影响CMA功能,是研究IBD的一个全新突破口。此外,IBD患者肠道粘膜的病变是由肠道微生态的失衡而引起的免疫紊乱所致。肠道正常的功能依赖于肠道微生物、肠上皮细胞和肠道免疫细胞三者之间的功能协调以及动态平衡。因此,对于携带IBD易感基因的个体来说,肠道内异常微生物的定植可能是IBD发病的根源,这也为我们研究IBD的发病机制以及潜在治疗方式提供了新的思路。方法1.利用Cre/lox P系统构建了肠道上皮特异性lamp2a过表达(specific intestinal epithelial cell-lamp2a knock-in,lamp2a-IECKI)小鼠。2.利用口服4%DSS溶液构建小鼠结肠炎模型,并监测造模过程中lamp2a-IECKI小鼠及其野生型(wild-type,WT)每天体重,粪便隐血以及小鼠活动度。3.在造模第10天处死小鼠,完整取出小鼠结肠并测量长度。通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)评价造模前后小鼠肠道结构的改变,并通过免疫组化来评价肠上皮细胞lamp2a过表达后肠道内炎症浸润情况。4.通过小鼠粪便16S rDNA高通量测序分析lamp2a-IECKI和WT小鼠肠道微生态,从而评价经lamp2a肠上皮细胞过表达后对肠道菌群的影响。结果1.成功建立lamp2a-IECKI小鼠模型。2.肠上皮细胞lamp2a过表达后增加小鼠对于DSS诱导结肠炎的敏感性:在口服DSS造模过程中,lamp2a-IECKI组小鼠体重下降明显,粪便潜血严重,小鼠活动度降低;造模结束后,对比小鼠结肠长度发现,lamp2a-IECKI小鼠结肠长度明显缩短,肠壁增厚变硬。3.肠上皮细胞lamp2a过表达后可能通过增强CMA加重炎症反应:DSS造模后,lamp2a-IECKI小鼠结肠上皮微绒毛结构排列紊乱,上皮细胞内溶酶体增多,提示CMA显著增强;炎性细胞浸润更明显,其中巨噬细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞数量明显增加,组织中IL-1释放增多,从而引起炎症级联反应,加重肠黏膜损伤。4.肠上皮细胞lamp2a过表达后小鼠菌群结构的改变可能增加DSS诱导结肠炎的易感性:lamp2a-IECKI小鼠菌群结构发生改变,其中Escherichia/Shigella等IBD相关致病菌的丰度增加。结论肠上皮细胞lampA2A过表达后可显著增强细胞CMA功能,一方面引起肠道内菌群结构的改变,致病菌定植增多,使得小鼠易感性增加。另一方面,肠上皮细胞CMA增强后,可能通过释放炎性介质,引起炎性浸润从而加重小鼠的炎症反应。

关键词： lamp2a 炎症性肠病 CMA DSS 肠道菌群

lamp2a介导的自噬通过清除过度氧化的DJ-1增强胃癌细胞的抗氧化应激能力

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LAMP2A介导的自噬通过清除过度氧化的DJ-1增强胃癌细胞的抗氧化应...

作者：乐双双广西医科大学

学位级别：硕士

目的:胃癌是最常见的消化道肿瘤,在全球的死亡率一直高居不下,严重威胁人类的生命。我国是胃癌的高发区,由于胃癌的早期症状比较隐匿,经常在晚期才被诊断出来,所以预后仍不理想。因此使用有效的筛查方法进行早期发现对降低胃癌死亡率非... 详细信息

目的:胃癌是最常见的消化道肿瘤,在全球的死亡率一直高居不下,严重威胁人类的生命。我国是胃癌的高发区,由于胃癌的早期症状比较隐匿,经常在晚期才被诊断出来,所以预后仍不理想。因此使用有效的筛查方法进行早期发现对降低胃癌死亡率非常重要。肿瘤分子标志物是提高胃癌生存率的重要诊断工具,目前常用的胃癌标志物特异性和灵敏度并不高,发现新的分子标志物有利于胃癌的早期诊断和改善预后。氧化应激表现为细胞内氧化和抗氧化作用失衡的一种状态,与神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病和许多其他病理有关,被认为是影响肿瘤发生和发展的重要因素之一。引起氧化应激的刺激因素包括缺氧,缺血,药物化疗等等,这些因素在实体瘤中很常见。氧化应激时细胞内活性氧ROS(Reactive oxygen species)水平升高,ROS是一把双刃剑,它既能调节细胞正常的增殖、分化和凋亡,但是过度氧化应激时产生的高浓度ROS却对细胞具有毒性作用。肿瘤细胞表现出异常的氧化还原动态平衡,其过度增殖伴随着高水平的ROS产生,但是肿瘤细胞通过提高自身的抗氧化能力来避免引发衰老、细胞凋亡或铁性下垂的ROS阈值。自噬参与调控细胞的增殖、凋亡、分化、蛋白质质量控制等多种生物学过程,是细胞内一种十分重要的生命活动,由于底物蛋白进入溶酶体的机制不同,自噬分为大自噬,微自噬和lamp2a(Lysosome-associated membrane glycoprotein 2A)相关的分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。近年来发现分子伴侣介导的自噬(CMA)在多种肿瘤中的表达上调,有利于维持肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性表型,且与肿瘤的耐药密切相关,肿瘤微环境的内在特征,如缺乏营养,缺氧和高活性氧(ROS)被证明是有效的CMA活化剂。研究表明CMA可通过广泛降解氧化损伤的蛋白而促进乳腺癌细胞的生存,但相关的分子机制并不清楚。因此,探究CMA与肿瘤细胞抗氧化应激之间的关系并阐明其具体的作用机制具有重要的研究价值。前期我实验室制备并筛选了MG7、MG5、MGd1等胃癌单克隆抗体,其中研究较多的是MG7抗体,已被证明在胃癌的诊断中具有很好的敏感性和特异性,具有预警作用。随后对MG5进行抗原鉴定,结果表明MG5识别的抗原是分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)中的关键受体分子lamp2a,大样本组织芯片证实lamp2a在胃癌组织中的表达高于癌旁组织,且在胃黏膜癌前病变中具有预警作用,是一个特异性的胃癌标志物。因此,本研究利用杂交瘤技术制备了10株lamp2a单克隆抗体,通过ELISA配对筛选出一对可用于临床血液和尿液检测的lamp2a抗体,初步建立lamp2a双抗体夹心ELISA检测方法,以此来监测胃癌的发生、发展。基于之前在分子伴侣介导的自噬(CMA)调节胃癌增殖方面的理论贡献和研究经验,本研究进一步探讨CMA在调节胃癌细胞抗氧化应激中的作用和分子机制。方法:1.选择纯种BALB/C小鼠,目的抗原免疫小鼠后取脾脏研碎,将制备好的免疫脾细胞同骨髓瘤细胞融合,45%PEG溶液处理后通过HAT选择培养基培养、杂交瘤克隆化筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系;通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞的方法收集含有单克隆抗体的腹水,硫酸铵纯化后获得10株lamp2a单克隆抗体;利用制备的抗体初步建立lamp2a双抗体夹心ELISA检测方法,用于临床胃癌患者血液和尿液的测定。2.实时定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测五种人胃癌细胞系和人正常胃黏膜细胞中lamp2a的m RNA和蛋白水平;使用不同浓度的过氧化氢(150μM和300μM)刺激胃癌细胞系24小时,构建重度氧化应激的细胞模型,蛋白免疫印迹检测氧化应激时lamp2a的蛋白水平变化。3.慢病毒转染技术构建lamp2a敲低和过表达胃癌细胞系,实时定量PCR和蛋白免疫印迹验证lamp2a的m RNA和蛋白水平;高浓度的过氧化氢刺激lamp2a稳转的胃癌细胞系,流式细胞术和CCK8检测细胞的凋亡和增殖。4.高浓度的过氧化氢刺激稳转的lamp2a下调胃癌细胞系,蛋白免疫印迹实验检测DJ-1(Parkinson disease protein 7,PARK7)和凋亡相关蛋白的水平。5.高浓度的过氧化氢刺激胃癌细胞系24小时,免疫共沉淀、免疫荧光验证lamp2a与DJ-1之间的相互作用,蛋白免疫印迹检测底物蛋白DJ-1的水平变化。结果:1.利用杂交瘤细胞技术制备了10株lamp2a单克隆抗体,ELISA检测抗体的效价结果良好;蛋白免疫印迹和免疫组化初步筛选出5株lamp2a单克隆抗体,结果表明这5株单克隆抗体均可用于WB、免疫组化实验,抗体的效果理想;成功配成了一对lamp2a抗体,初步建立lamp2a双抗体夹心ELISA方法,标准品经不同浓度稀释后进行检测,结果表明所构建的标准曲线良好,可

关键词： lamp2a 肿瘤标志物分子伴侣介导的自噬 DJ-1 凋亡

阿米洛利对PC12细胞的保护作用及其对lamp2a表达影响

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基础医学与临床 2011年第10期31卷 1124-1128页

作者：赵长振徐耑张润娉孔岩苏州高新区狮山街道社区卫生服务中心江苏苏州215011 苏州大学苏州大学附属第一医院神经内科江苏苏州215006

目的研究阿米洛利对PC12细胞的保护作用,及其对lamp2a表达水平的影响。方法 pH 6.0的酸性培养液诱导PC12细胞损伤,同时给予阿米洛利进行干预,四甲基偶氮唑盐(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)和流式细胞技术检测细胞存活率、损伤程度及凋亡率,West... 详细信息

目的研究阿米洛利对PC12细胞的保护作用,及其对lamp2a表达水平的影响。方法 pH 6.0的酸性培养液诱导PC12细胞损伤,同时给予阿米洛利进行干预,四甲基偶氮唑盐(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)和流式细胞技术检测细胞存活率、损伤程度及凋亡率,Western blot检测lamp2a表达水平。结果酸性培养液处理24 h,细胞存活率降低至(67.2±5.1)%,上清液中的LDH增多至(407.9±11.1)U/L,凋亡率升高至(27.8±2.6)%。阿米洛利(100μmol/L)提高PC12细胞的存活率至(84.9±2.2)%,LDH降低至(314.1±5.2)U/L,细胞凋亡率降低至(17.8±1.3)%,与pH 6.0组相比(Plamp2a表达升高,而阿米洛利能够显著抑制lamp2a的表达(Plamp2a的表达发挥神经保护作用。

关键词：阿米洛利 lamp2a 分子伴侣自噬 PC12细胞帕金森病

电针对帕金森病模型大鼠脑黑质内lamp2a、Hsc70、α-syn表达的影响

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中华中医药学刊 2018年第4期36卷 859-862,I0009页

作者：马骏余沛豪王述菊王中明王彦春王琪王彬湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心

目的：观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）模型大鼠脑黑质内lamp2a、Hsc70、α-syn表达的影响,探讨电针治疗帕金森病的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针治疗组,每组15只... 详细信息

目的：观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）模型大鼠脑黑质内lamp2a、Hsc70、α-syn表达的影响,探讨电针治疗帕金森病的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针治疗组,每组15只。采取颈背部皮下注射鱼藤酮法制备帕金森病模型,假手术组只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液。正常组、假手术组、模型组不进行任何治疗;电针治疗组在造模完成后取穴＂风府＂、＂太冲＂,连续波,频率120次/min,每次治疗20 min,每天1次,疗程为28 d。免疫组化法检测模型大鼠黑质内TH、α-syn的阳性表达,并用Western blot法检测模型大鼠黑质内lamp2a、Hsc70、α-syn的表达。结果：模型组大鼠表现出明显的PD症候群特征,电针干预后模型大鼠行为学评分明显降低（P〈0.01）;免疫组化法及Westernblot检测显示电针治疗通过上调lamp2a、Hsc70水平能抑制错误折叠蛋白α-syn的表达,提高TH的阳性表达。结论：电针可以抑制具有细胞毒性作用的α-syn的集聚,保护多巴胺能神经元,抑制帕金森病的发展,其机制可能与干预分子伴侣介导的自噬有关。

关键词：帕金森病电针分子伴侣介导的自噬 lamp2a Hsc70 α-syn

Inhibition of tumor suppressor p73 by nerve growth factor receptor via chaperone-mediated autophagy

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Journal of Molecular Cell Biology 2020年第9期12卷 700-712页

作者： Daniel Nguyen Kun Yang Lucia Chiao Yun Deng Xiang Zhou Zhen Zhang Shelya X.Zeng Hua Lu Department of Biochemistry and Molecular Biology Tulane Cancer CenterTulane University School of MedicineNew OrleansLA 70112USA Department of Radiation Oncology Shanghai Cancer CenterDepartment of OncologyShanghai Medical SchoolFudan UniversityShanghai 200032China Present address:Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology Baylor College of MedicineHoustonTX 77030USA Present address:Department of Radiation Oncology Shanghai Cancer CenterFudan UniversityShanghai 200032China Present address:Institute of Biomedical Sciences Shanghai Cancer CenterFudan UniversityShanghai 200032China

The tumor suppressr p73 is a homolog of p53 and is capable of inducing cell cycle arrest and apoptosis.Here,we identify nerve growth factor receptor(NGFR,p75NTR,or CD271)as a novel negative p73 regulator.p73 activates NGFR transcription,which,in turn,promotes p73 degradation in a negative feedback loop.NGFR directly binds to p73 central DNA-binding domain and suppresses p73 transcriptional activity as well as p73-mediated apoptosis in cancer cells.Surprisingly,we uncover a previously unknown mechanism of NGFR-facilitated p73 degradation through the chaperone-mediated autophagy(CMA)pathway.Collectively,our studies demonstrate a new oncogenic function for NGFR in inactivating p73 activity by promoting its degradation through the CMA.

关键词： p73 NGFR chaperone-mediated autophagy lamp2a HSPA8

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结直肠癌中lamp2a表达的临床病理意义

结直肠癌中LAMP2a表达的临床病理意义

作者：时帅锦州医科大学

学位级别：硕士

目的讨论癌基因溶酶体相关膜蛋白-2（lamp2a）在肿瘤发生中的主要作用,在结直肠癌组织中表达及其临床病理意义。方法1、应用RT-PCR方法检测24例癌组织及癌旁正常组织中lamp2a mRNA的表达。2、采用蛋白印迹方法检测71例冰冻结直肠癌及癌... 详细信息

目的讨论癌基因溶酶体相关膜蛋白-2（lamp2a）在肿瘤发生中的主要作用,在结直肠癌组织中表达及其临床病理意义。方法1、应用RT-PCR方法检测24例癌组织及癌旁正常组织中lamp2a mRNA的表达。2、采用蛋白印迹方法检测71例冰冻结直肠癌及癌旁正常组织中lamp2a蛋白表达水平。3、为了避免细胞污染我们采用激光捕捉显微切割（LCM）鉴别结直肠腺癌病灶和正常腺上皮中lamp2a mRNA的表达水平。4、构建组织芯片,利用免疫组化方法检测结直肠癌、癌旁正常组织和腺瘤中lamp2a的表达,分析结直肠癌中lamp2a的临床病理特征。5、结直肠癌中lamp2 mRNA表达的生物信息学分析（Oncomine和TCGA数据库）。6、应用SPSS 17.0统计软件分析数据,数据用均值±标准差表示,组内差异采用独立样本T检验,Spearman等级分析用来分析结直肠癌组织不同病理特征与lamp2a的关系,生存分析采用Kaplan-Meier法,Cox比例风险回归分析建立多因素生存分析数据的危险模型。结果1、结直肠癌组织中lamp2a mRNA及蛋白的表达实时PCR结果显示结直肠癌组织中lamp2a mRNA表达水平低于癌旁组织（P＜0.05）。利用激光捕捉显微切割技术（LCM）试剂盒检测lamp2a mRNA表达情况,结果显示,lamp2a mRNA在结直肠癌组织中低于正常组织。在结直肠癌组织中lamp2a蛋白表达水平高于正常粘膜组织（P＜0.05）。2、结直肠癌组织中lamp2a蛋白表达与临床病理特征的关系。结直肠癌中lamp2a表达高于癌旁正常粘膜（P＜0.05）,lamp2a表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移呈负相关（P＜0.05）,但与淋巴管浸润、肝转移、浸润深度和分化程度无相关性（P＜0.05）。生存分析结果显示lamp2a阳性表达与患者生存率无统计学意义（P＞0.05）。Cox比例风险模型表明,肿瘤浸润深度和远处转移是结直肠癌独立预后因素（P＜0.05）。3、根据Skrzypczak2和TCGA的数据进行生物信息学分析,发现lamp2m RNA在结肠组织中表达高于结肠腺瘤,在直肠中出现了同样的结果。TCGA数据还显示lamp2 mRNA在结肠中表达高于直肠组织。MSI-和K-ras患者中lamp2表达高于阳性患者。BRAF基因表达正常患者中lamp2表达高于表达异常者。结论1、结直肠癌组织中lamp2a m RNA表达水平低于癌旁正常组织,而蛋白表达高于癌旁正常组织。2、临床病理分析结果表明lamp2a表达与结直肠癌TNM分期和淋巴结转移呈负相关。根据蛋白表达绘制出结直肠癌生存曲线,lamp2a阳性表达与患者生存率无相关性。3、Cox比例风险模型表明,肿瘤浸润深度和远处转移是结直肠癌独立预后因素

关键词：结直肠癌 lamp2a 肿瘤发生演进预后