LAMP2A改善帕金森病恒河猴模型的运动功能及其作用机制

作     者：朱旭超 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张玲;张钰;窦长松

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：LAMP2A 帕金森病 CMA 行为学 SH-SY5Y 

摘      要：背景:散发性帕金森病(sporadic Parkinson’s disease,sPD)的发病机制未明(以下统称为PD),尚无有效的根治措施。PD的主要病理学表现为α-syn及其聚集体如路易小体(Lewybodies,LBs)在脑内的沉积。近些年的研究发现α-syn/LBs具有朊蛋白样特性,在PD的发病中起着不可忽视的作用。同时,PD病人与啮齿类动物模型出现分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)的异常,其中CMA的关键分子LAMP2A表达下降。我们前期在大鼠模型研究结果也提示LAMP2A表达降低可能通过减少α-syn的CMA自噬途径,增加α-syn的沉积和聚集,从而参与PD的发病。为进一步验证上述假设并探讨LAMP2A在PD中的作用机制,我们通过构建人源性PD的恒河猴动物模型和PFF诱导的SH-SY5Y细胞模型,通过运动行为学,分子生物学等方法研究过表达LAMP2A对PD潜在治疗作用的初步机制,以期为PD的发病机制和治疗提供线索。方法:1.应用立体定位注射仪向7只恒河猴的右脑纹状体区注射sPD患者死亡后脑组织(荷兰脑库)的路易小体(Lewy bodies,LBs)提取物,同时在左脑纹状体区注射非PD病人死亡后的脑组织(荷兰脑库)提取物来构建PD恒河猴模型;2.模型动物随机分为两组,LAMP2A过表达组(n=4)在其黑质区双侧注射过表达LAMP2A的腺相关病毒载体;模型组(n=3)在黑质区双侧注射对照病毒载体;3.通过取物实验、旷场、阶梯实验、平板取食实验评价PD恒河猴模型运动能力和LAMP2A对该PD模型运动功能的影响;4.利用ELISA法对PD恒河猴模型脑脊液、血清的总α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)及磷酸化α-syn(Ser129)水平进行测定;5.构建PD细胞模型和分组:利用超声处理后的α-syn前体原纤维(PFF)与SH-SY5Y共孵育48h,PFF终浓度为2μg/μL,确定建模方法和条件;利用慢病毒构建LAMP2A过表达、LAMP2A低表达、LAMP2A空载体细胞系,并以PFF的处理与否,设置6个细胞实验分组;6.利用RT-PCR检测LAMP2A转录;荧光显微镜检测慢病毒转染效率;Western Blot检测LAMP2A、磷酸化α-syn、RILP的表达情况;丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞氧化应激指标;活细胞溶酶体染色标记细胞内溶酶体数量。结果:1.过表达LAMP2恒河猴与模型组的认知能力和一般运动水平没有显著变化;***2A过表达组在精细运动实验中上肢抓取效率高于模型组;***测定模型组术后12月脑脊液、血清的总α-syn水平及磷酸化α-syn水平显著增高;LAMP2A过表达组PD恒河猴模型的脑脊液、血清磷酸化的α-syn水平在术后第8月起均低于同期模型组;4.过表达LAMP2A降低了 SH-SY5Y细胞的氧化应激水平;5.过表达LAMP2A增加细胞CMA活性以及SH-SY5Y细胞内溶酶体的生成、转运提高了磷酸化α-syn的清除效率。结论:过表达LAMP2A通过增加α-syn的CMA清除从而改善了 PD恒河猴模型精细运动能力。体外实验也表明过表达LAMP2A可以降低PD细胞模型的氧化应激水平、增加了细胞的溶酶体生成和转运。本研究为进一步研究PD的发病机制和治疗提供了参考,同时也为非人灵长类动物模型的行为学研究提供了方法依据。