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Construction and identification of recombination expression vector Ksp-Cadherin-Gpx1-klk1

Journal of Pharmaceutical Analysis 2008年第4期20卷 217-220,255页

作者：解立怡薛武军项和立麻孙凯 Renal Disease Center the First Affiliated Hospital Medical School of Xi'an Jiaotong University Renal Disease Center the First Affiliated Hospital Medical School of Xi'an Jiaotong University Shanghai Research Center for Bio model Organism

Objective To construct and identify the Gpx1-klk1 vector which contains kidney-specific promoter (Ksp-cadherin). Methods Through PCR amplification, the human Gpx1, klk1, and Ksp-cadherin cDNA were obtained by taking Gpx1 cDNA, klk1 cDNA, and Ksp-cadherin BAC as templates. After being testified, the PCR products were inserted into the expressive vector pIRES-EGFP step-by-step to produce a recombinant vector Ksp-cadherin-Gpx1-klk1. This vector was examined by restriction enzyme digestion and sequence analysis. Results The recombinant expressive vector Ksp-cadherin-Gpx1-klk1 was successfully constructed. Conclusion The construction of the recombinant vector Ksp-cadherin-Gpx1-klk1 laid foundations for investigations in establishing transgenic animal models, the over-expression of Gpx1 and klk1 in mammal kidney, and gene therapy for ischemia-reperfusion injury during kidney transplantation.

关键词： Gpx1 klk1 Ksp-cadherin ischemic-reperfusion injury

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基于单细胞测序技术探究klk1在肝细胞癌中的作用

基于单细胞测序技术探究KLK1在肝细胞癌中的作用

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作者：郑滨南方医科大学

学位级别：硕士

背景及目的原发性肝癌是全球发病率第六位的恶性肿瘤,其死亡率位居癌症相关死亡的第三位,而肝细胞癌(HCC)作为原发性肝癌的主要亚型,占总发病率的75-85%。HCC是高度异质性的恶性肿瘤,其发病机制尚未完全阐明,特异性生物标志物仍然缺乏,... 详细信息

背景及目的原发性肝癌是全球发病率第六位的恶性肿瘤,其死亡率位居癌症相关死亡的第三位,而肝细胞癌(HCC)作为原发性肝癌的主要亚型,占总发病率的75-85%。HCC是高度异质性的恶性肿瘤,其发病机制尚未完全阐明,特异性生物标志物仍然缺乏,导致肝癌患者诊断时大多处于中晚期,治疗效果有限,复发率高,生存时间短,生存质量下降。研究表明klk1可以通过调节相关信号通路来影响纤维化和氧化应激,有可能作为癌症的生物标记物。本研究利用单细胞测序技术探究HCC的生物标记物及分子机制,对HCC的早期诊断及治疗提供一定的参考,具有重要的临床意义。方法1.本研究从GEO数据库中获取HCC的单细胞转录组谱,通过单细胞测序技术,筛选出HCC的差异基因。2.将GEO数据库筛选出的差异基因与TCGA数据库进行基因共识聚类,筛选出HCC的关键基因。3.对关键基因进行GO与KEGG富集分析及PPI网络构建,探究关键基因对HCC发病机制的影响。4.通过Western Blotting验证HCC中关键基因的表达。5.通过siRNA转染技术构建关键基因敲除的HCC细胞系,并通过Western Blotting验证。6.通过细胞增殖实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell细胞迁移及侵袭实验来验证敲除关键基因对HCC增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果1.通过单细胞测序技术,筛选出肝癌的差异基因,并将其与TCGA数据库进行基因共识聚类,筛选出肝癌的关键基因klk1。2.在GO富集分析中,可以看到差异基因参与的生物过程主要为免疫细胞的迁移、炎症反应的调节及血管生成的调节,其分子功能主要与丝氨酸的活性与水解及细胞因子的活性和结合有关。3.在KEGG富集分析中,差异基因主要参与的信号通路为:IL-17信号通路、内质网中的蛋白质加工及细胞因子与受体的相互作用。4.通过构建蛋白质互作网络,我们获得了与关键基因klk1表达相关的基因:KNG1、SERPNA4、IGF1、IGF2、IGFALS、IGFBP3。5.我们通过Western Blotting验证了关键基因klk1在HCC细胞株中高表达。6.通过siRNA转染技术,我们对人肝细胞癌Huh7细胞株进行siRNA-klk1敲低,并通过Western Blotting实验证实了转染效果明显。7.在细胞增殖实验与平板克隆形成实验中,klk1敲低细胞株的增殖能力比对照组明显降低。在细胞划痕实验及Transwell迁移和侵袭实验中,klk1敲低细胞株的迁移和侵袭能力比对照组明显降低。结论1.在HCC中基因klk1高表达,为HCC的关键基因;***1高表达可以促进HCC的增殖、迁移与侵袭能力。

关键词： klk1 肝细胞癌单细胞测序技术肿瘤进展

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转基因表达klk1抵抗压力负荷引起的心室重构

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中国分子心脏病学杂志 2013年第3期13卷 559-564页

作者：鲍丹吕丹董伟陈炜路迎冬张连峰中国医学科学院医学实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室北京市100021

目的 klk1基因对高血压具有保护作用,klk1在心脏中也有所表达,但目前对klk1基因在心肌中的作用所知甚少。本研究通过建立klk1基因转基因小鼠,在压力负荷的条件下,研究klk1对心室重构的作用。方法把人klk1基因插入鸡β-肌动蛋白启动子下... 详细信息

目的 klk1基因对高血压具有保护作用,klk1在心脏中也有所表达,但目前对klk1基因在心肌中的作用所知甚少。本研究通过建立klk1基因转基因小鼠,在压力负荷的条件下,研究klk1对心室重构的作用。方法把人klk1基因插入鸡β-肌动蛋白启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6Jklk1转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型。采用Western Blot鉴定klk1在心脏、大血管和肾脏中的表达筛选高表达转基因品系。用无创血压仪测量血压,利用超声影像分析技术和病理学观察转基因小鼠心脏结构与功能改变。结果建立了在心脏、肾脏和大血管壁高表达klk1基因的转基因小鼠。在正常情况下,与同窝转基因阴性小鼠相比,转基因小鼠心脏结构和功能无显著变化。主动脉缩窄术后1个月,由于压力负荷的存在,同窝阴性小鼠左心室壁厚病理性肥厚,而转基因表达的klk1可明显地抑制左心室壁肥厚的进程;主动脉缩窄术后2个月,同窝阴性小鼠心脏进入到病理性扩张阶段,klk1也表现出对心肌病理性扩张的抑制,同时,组织学染色显示klk1转基因小鼠心肌肥厚与纤维化程度减弱。结论转基因表达klk1可抵抗压力负荷引起的心室重构。

关键词： klk1 转基因压力负荷心室重构

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激肽释放酶转基因大鼠模型的建立

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中国比较医学杂志 2007年第8期17卷 463-466页

作者：郑志红杨葳周生来王维董婉维李兆阳孙强张梅英李华王禄增中国医科大学实验动物部辽宁省实验动物转基因重点实验室沈阳110001 华东师范大学上海200062

目的建立klk1转基因大鼠模型。方法腹腔注射PMSG-HCG（150-150IU/kg）超排不同周龄（4-8周）SD大鼠比较超排效果的差异，以可用于注射胚胎数作为评判标准确定最佳超排周龄。构建pBC-klk1转基因构件，经酶切、纯化后通过显微注射方法导... 详细信息

目的建立klk1转基因大鼠模型。方法腹腔注射PMSG-HCG（150-150IU/kg）超排不同周龄（4-8周）SD大鼠比较超排效果的差异，以可用于注射胚胎数作为评判标准确定最佳超排周龄。构建pBC-klk1转基因构件，经酶切、纯化后通过显微注射方法导入SD大鼠受精卵原核并移植到同期受孕的SD受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型，通过RT-PCR和免疫组化方法检测klk1基因表达。结果4-8周SD大鼠超排后分别获得受精卵14±14.8、30±15.2、13.3±13.7、13±14.7、8±5.7，5周龄大鼠超排效果最好，与其他周龄大鼠相比有显差异，P〈0.05；显微注射1538枚卵，移植685（44.53%）枚卵于31只受体输卵管中，12（12/31，38.7%）只怀孕，共产仔62只，经PCR检测获得6只阳性鼠，Southern检测3只阳性。对Southern检测阳性转基因大鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明klk1基因在肾脏、胰腺和乳腺内表达。结论成功建立klk1基因表达的转基因大鼠模型，该模型是高血压病研究的理想动物模型。

关键词：大鼠 klk1 转基因高血压

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KNG1的低分子量激肽原LMWK参与清平猪分娩启动的机制研究

KNG1的低分子量激肽原LMWK参与清平猪分娩启动的机制研究

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作者：赵虎成华中农业大学

学位级别：硕士

清平猪是湖北省的优良地方品种,具有妊娠期短的特性。妊娠期短可以缩短母猪的繁殖周期,提高其繁殖性能,降低养殖成本,提高经济效益。短妊娠现象是分娩过程提前发生引起的,分娩启动受母体激素、炎症反应和胎儿大小等多种因素影响,其中炎... 详细信息

清平猪是湖北省的优良地方品种,具有妊娠期短的特性。妊娠期短可以缩短母猪的繁殖周期,提高其繁殖性能,降低养殖成本,提高经济效益。短妊娠现象是分娩过程提前发生引起的,分娩启动受母体激素、炎症反应和胎儿大小等多种因素影响,其中炎症反应可以促进母体子宫收缩,胎膜破裂引发分娩。课题组前期采用转录组测序、全基因组关联分析、选择性扫描等方法筛选出了清平猪母猪妊娠期和分娩期差异表达候选基因激肽原1(kininogen 1,KNG1)。研究表明,KNG1的mRNA通过可变剪接与加工产生两种剪接体:低分子量激肽原(low molecular weight kininogen,LMWK)与高分子量激肽原(high molecular weight kininogen,HMWK),其中LMWK能够被激肽释放酶1(kallikrein 1,klk1)酶切,产生促炎的小分子肽—缓激肽(bradykinin,BK),BK通过与缓激肽受体B2(bradykinin receptor B2,BKR2)结合,促进前列腺素的生成,引起分娩。但KNG1的低分子量激肽原—LMWK,在分娩中的表达受到调控的机制以及是否可以通过引起炎症反应导致分娩启动,目前尚不清楚。因此本研究以清平猪母猪及昆明鼠母鼠为研究对象,探究KNG1的低分子量激肽原LMWK引发分娩启动的分子机制。主要研究结果如下:1、LMWK和klk1与清平猪母猪短妊娠现象有关(1)Western blot结果表明LMWK、klk1在有分娩征兆短妊娠期清平猪(妊娠期第111 d,编号:PAR111Q)胎盘中的表达比无分娩征兆清平猪(妊娠期第109d,编号:PRE109Q)极显著上调(P1);在有分娩征兆短妊娠期清平猪(妊娠期第111 d,编号:PAR111Q)胎盘中比有分娩征兆正常妊娠期清平猪(妊娠期第114 d,编号:PAR114Q)和大白猪(妊娠期第114 d,编号:PAR114D)显著上调(P111 d,编号:PAR111Q)胎盘中的IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达水平比无分娩征兆清平猪(妊娠期第109d,编号:PRE109Q)显著上调(P1)对妊娠15.5 d的母鼠腹腔注射雌激素,与注射PBS的对照组相比孕鼠妊娠时间极显著缩短(P1);炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8与BK的表达量极显著上调(P1),LMWK表达量和P65磷酸化水平显著上调(P1μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L雌激素(试验组),Western blot和RT-qPCR结果表明,与对照组相比,试验组中LMWK、klk1和细胞炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8)的表达水平均显著上调(Pklk1的表达,引起炎症反应。(3)在细胞培养基中添加PBS、BK、BKR2抑制剂HOE 140、BK+HOE 140后,收取胎盘细胞样品进行Western blot、RT-qPCR分析。结果表明,相较于添加PBS的对照组,添加BK后,BKR2、IL-1β、IL-6和IL-8的表达以及P65磷酸化水平显著上调(P140后,BKR2蛋白表达水平、P65磷酸化表达极显著下调(P1),IL-6表达显著下调(P1β和IL-8表达极显著下调(P1)。以上结果表明,BK通过BKR2激活NF-κB通路,引发炎症反应。(4)对妊娠15.5 d的母鼠分别注射PBS和BK,与注射PBS的对照组相比,注射BK能够缩短小鼠妊娠时间(P1);BKR2蛋白表达水平与P65的磷酸化水平显著上调(P1β、IL-6、IL-8的mRNA水平均显著上调(P1是清平猪短妊娠现象的关键候选基因;雌激素通过提高LMWK的表达,促进BK与BKR2结合,激活NF-κB通路,引发炎症反应,从而提前分娩。

关键词：分娩启动雌激素 KNG1 LMWK klk1 炎症 NF-κB

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血清激肽释放酶1和激肽释放酶6水平与MS复发关系的研究

血清激肽释放酶1和激肽释放酶6水平与MS复发关系的研究

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作者：王梦涵郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种以多发性病灶及缓解复发的病程为临床特点的脱髓鞘疾病,近年来研究表明自身免疫可能是其主要的致病机制。激肽释放酶1(kallikreinl, klk1)和激肽释放酶6(kallikrein6, klk6)是一种... 详细信息

背景与目的多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种以多发性病灶及缓解复发的病程为临床特点的脱髓鞘疾病,近年来研究表明自身免疫可能是其主要的致病机制。激肽释放酶1(kallikreinl, klk1)和激肽释放酶6(kallikrein6, klk6)是一种已被证实的在中枢及非中枢神经系统疾病中起作用的丝氨酸蛋白酶类家族的成员。有研究表明激肽释放酶与MS患者病灶中的髓鞘脱失及其所致的轴索损伤相关,本研究探讨klk1、klk6水平与MS复发之间的关系,了解它们在多发性硬化症中潜在活性作用,从而进一步研究MS的复发机制。资料与方法收集2007-2010年在郑州大学第一附属医院神经内科住院的首次发作急性期MS患者50例,年龄15-50岁,平均35.2±5.4岁;多次发作急性期,多发性硬化患者50例,发作次数2-8次,平均3.9±1.4次,年龄16-52岁,平均年龄：30.4±7.1岁。上述实验组MS患者诊断均符合McDonald诊断的标准,均为实验室或临床确诊病例,并对两组MS患者分别进行神经功能缺损程度的扩展残疾状况评分量表(an expanded disability status scales,EDSS)评分,初次发作组EDSS评分为3.8±1.4,多次发作组EDSS评分为4.4±1.7。对照组选取同期住院的其他神经系统疾病患者50例,年龄19-58岁,平均年龄：36.1±6.3岁;健康志愿者50例,年龄16-56岁,平均年龄：34.1±7.3岁。各组研究对象在年龄、性别方面匹配,差异无统计学意义。所有受试者近期均无感染史,无其他自身免疫性疾病史和过敏性疾病史。本研究所有受试者均被告知实验目的,同时征得受试者同意并在知情同意书上签字后进行。所有受试对象于清晨空腹采集各组外周静脉血3ml,加入抗凝试管,以2000 r/min离心5 min后,取上层血清置于-70℃冰箱冷藏待用。用ELISA法对各组klk1、klk6水平进行检测。所有数据均以x±s表示,应用SPSS13.0软件进行统计,首先运用方差齐性检验,如果方差齐,则用单因素方差分析进行统计分析,组间比较采用LSD法,Pklkl水平均显著高于其他神经系统疾病者对照组和正常对照组(Pklkl水平亦显著高于初发组(Pklk1水平无明显差异(P>0.05)。***初发组与复发组急性期血清klk6水平均显著高于其他神经系统疾病者对照组和正常对照组(Pklk6水平无明显差异(P>0.05)。***组EDSS评分与klk1血清浓度无显著性相关(P>0.01);MS组EDSS评分与klk6血清浓度无显著性相关(P>0.01)。***患者血清klk1水平与疾病的复发呈正相关(r=0.667 Pklk6水平与疾病的复发亦呈正相关(r=0.500 Pklk1水平均显著高于其他神经系统疾病者对照组和正常对照组,提示klkl在MS的病程中发挥作用。***患者复发期血清klk1水平亦显著高于初发期,且klk1浓度与MS疾病的复发成正相关性,推测klk1可能参与MS复发。***患者初发期与复发期血清klk6水平均显著高于其他神经系统疾病者对照组和正常对照组,提示klk6在多发性硬化症的病程中可能发挥作用。***患者复发期血清klk6水平亦显著高于初发期,且klk6浓度与MS疾病的复发成正相关性,推测klk6可能与MS的复发相关。

关键词：多发性硬化复发 klk1 klk6

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