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LPA2、klf5在胃腺癌组织中的表达及其临床病理学意义

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LPA2、KLF5在胃腺癌组织中的表达及其临床病理学意义

作者：张志丽兰州大学

学位级别：硕士

目的:研究溶血磷脂酸受体2蛋白(LPA2)、Krüppel样因子5(klf5)在胃正常黏膜、上皮内瘤变和胃腺癌组织芯片中表达水平的差异,分析两种蛋白与胃腺癌患者临床病理特征的关系,以及在胃腺癌中两者之间的相关性,并进一步探讨溶血磷脂酸受体2蛋... 详细信息

目的:研究溶血磷脂酸受体2蛋白(LPA2)、Krüppel样因子5(klf5)在胃正常黏膜、上皮内瘤变和胃腺癌组织芯片中表达水平的差异,分析两种蛋白与胃腺癌患者临床病理特征的关系,以及在胃腺癌中两者之间的相关性,并进一步探讨溶血磷脂酸受体2蛋白(LPA2)及Krüppel样因子5(klf5)在胃腺癌发生、发展及预后中的作用。方法:选取51例手术切除胃腺癌组织标本、21例上皮内瘤变标本及13例正常胃黏膜标本为研究对象,并制作组织芯片,采用免疫组织化学SP法检测LPA2和klf5在胃正常黏膜、上皮内瘤变和胃腺癌组织中的表达,并分析两种蛋白与患者预后的相关性。结果:1.LPA2主要表达于细胞质和胞膜,呈棕褐色颗粒状,在胃低分化腺癌组、中分化腺癌组、高分化腺癌组、高级别上皮内瘤变组、低级别上皮内瘤变组及正常胃黏膜组中的阳性表达率分别为89.5%(17/19)、81.3%(13/16)、25.0%(4/16)、33.3%(3/9)、25.0%(3/12)和23.1%(3/13),癌组织的阳性率显著高于上皮内瘤变组织和正常胃黏膜组织,差异具有统计学意义(χ2=29.9,P5.0%(4/16),两组患者LPA2蛋白的阳性率差异无统计学意义(χ2=0.20,P>0.05)。3.在胃腺癌组织中,LPA2阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤的部位、肿瘤的直径及组织学分级无关(P>0.05),而与患者肿瘤的浸润深度、Lauren分型、是否侵犯脉管、区域淋巴结转移情况及临床分期有关(P5)。浸润浆膜层、Lauren分型弥漫型、有脉管侵犯、存在区域淋巴结转移和晚期的患者LPA2阳性率显著高于未浸润浆膜层、Lauren分型肠型、无脉管侵犯、无区域淋巴结转移和早期的患者。4.klf5主要表达于细胞质,呈棕褐色颗粒状,在胃低分化腺癌组、中分化腺癌组、高分化腺癌组、高级别上皮内瘤变组、低级别上皮内瘤变组及正常胃黏膜组中的阳性表达率分别为78.9%(15/19)、75.0%(12/16)、75.0%(12/16)、66.7%(6/9)、58.3%(7/12)和38.5%(5/13),癌组织的阳性率高于上皮内瘤变组织和正常胃黏膜组织,阳性表达率逐渐降低,但差异无统计学意义(χ2=7.35,P>0.05)。5.在胃腺癌组织中,klf5的阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤的部位、肿瘤的直径、组织学分级、浸润深度、Lauren分型、是否侵犯脉管、区域淋巴结转移情况及临床分期均无关,差异无统计学意义(P>0.05)。6.在胃腺癌组织中,LPA2阳性组和阴性组的患者中位生存时间分别为11.02个月和23.04个月,两组比较死亡风险差别有统计学意义(HR=1.89,95%CI:1.11-3.63,P5)。7.在胃腺癌组织中,klf5阳性组和阴性组的患者中位生存时间分别为10.7个月和12.1个月,两组比较死亡风险差别无统计学意义(HR=1.11,95%CI:0.53-2.363,P>0.05)。8.在胃腺癌组织中,klf5与LPA2蛋白的表达呈正相关性(γ=0.66,P5)。结论:1.LPA2蛋白在胃腺癌组织中高表达,其阳性表达与患者肿瘤的浸润深度、Lauren分型、是否侵犯脉管、区域淋巴结转移情况及临床分期有密切关系,提示LPA2可能参与胃腺癌的发生,并且可作为判断胃腺癌发展、转移的一个重要指标。2.LPA2蛋白在胃腺癌中阳性组患者较阴性组患者生存时间短,提示其检测可能有助于评估胃腺癌患者的预后。3.klf5与LPA2在胃腺癌组织中的表达呈正相关,提示两者间可能存在一种相互关联的机制,从而在胃腺癌中发挥作用。

关键词：胃腺癌组织芯片免疫组化 LPA2 klf5

血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响及通心络的干预作用

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血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响及通心络的干...

作者：李利敏河北医科大学

学位级别：硕士

目的：紧密连接存在于血管内皮细胞及各类上皮细胞之间，常围绕上皮细胞或内皮细胞的顶端呈连续带状,使相邻的细胞紧密连接在一起，形成细胞间天然的物理屏障，起着选择性通透和维持细胞极性、维持细胞内环境稳态及参与细胞增殖的作用... 详细信息

目的：紧密连接存在于血管内皮细胞及各类上皮细胞之间，常围绕上皮细胞或内皮细胞的顶端呈连续带状,使相邻的细胞紧密连接在一起，形成细胞间天然的物理屏障，起着选择性通透和维持细胞极性、维持细胞内环境稳态及参与细胞增殖的作用。肾素血管紧张素（RAS）系统在心血管疾病的发生发展中发挥着重要作用，血管紧张素Ⅱ是RAS系统中最重要的效应因子之一，AngⅡ是一种内源性多肽，在生理条件下维持心血管系统的内稳态。在病理条件下，通过激活多条信号通路来参与心肌肥大、血管内膜增生、心脏重塑等心血管疾病的发生与发展。Krüppel样因子5（krüppel-like factor5, klf5）是一种含有锌指结构的转录调节因子,其C-末端的3个锌指结构域是DNA结合域，N端主要发挥转录激活作用。通过调节不同的信号通路来诱导相关因子的表达，进而引起细胞生物学效应，如参与细胞增殖和分化、炎症反应和细胞凋亡，是生物体内重要的信号转导系统之一。通心络（TXL）胶囊是依据传统中医的络病理论研制而成的复方制剂。它由动物药、植物药等12味中药组成，1996年被中国国家食品药品管理局批准用于治疗冠心病和缺血性脑中风。既往研究证明，通心络具有强效的血管保护作用，例如改善内皮细胞功能、降低血脂、抑制炎症、防治动脉粥样硬化和促进血管新生。但通心络对内皮细胞保护作用的机制还不是很清楚，本文主要研究通心络对内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响及其作用机制。方法：Western blot分析和免疫组化检测AngⅡ及TXL对klf5和紧密连接蛋白表达的影响;Real-time PCR检测klf5mRNA和紧密连接蛋白mRNA表达水平。结果：1AngⅡ抑制klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin表达Western blot分析显示，加入AngⅡ刺激后，klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达水平下降。Real-timePCR结果也显示，与对照组相比，AngⅡ刺激后，klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的mRNA表达水平下降。这些结果表明, AngⅡ抑制klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达。2TXL能够浓度依赖性的逆转由AngⅡ诱导的klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达下调为了研究TXL对klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的影响，我们用不同浓度的TXL预孵育细胞24h，然后再给予AngⅡ刺激24h。Western blot分析结果显示，随着TXL浓度增加，klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin表达水平呈剂量依赖性升高，于600μg/ml达到高峰。血管紧张素原转基因小鼠腹主动脉免疫组化染色也显示，与对照组相比，TXL组klf5和紧密连接蛋白表达明显上调。3过表达klf5促进内皮细胞紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin和occludin表达Western blot结果显示，过表达klf5后紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin和occludin的表达显著增多，而敲低klf5使其表达水平下降。Real-time PCR结果与Western blot结果相一致。这些结果提示，klf5介导内皮细胞紧密连接蛋白基因的表达。4敲低klf5阻断由TXL引起的紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin和beta-catenin的表达上调上述结果表明，敲低klf5后使紧密连接蛋白表达下调。为了检测TXL对紧密连接蛋白表达的上调是否由转录因子klf5介导，我们先用预TXL孵育细胞24h，然后用靶向klf5的siRNA转染内皮细胞，检测TXL对敲低klf5的内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响。Western blot分析结果显示，在敲低klf5内皮细胞中，TXL不能再上调紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达。结果表明，通心络通过上调klf5而使紧密连接蛋表达增加。结论：1AngⅡ抑制klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、occludin、beta-catenin的表达。2TXL浓度能够浓度依赖性的逆转由AngⅡ诱导的klf5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin

关键词：内皮细胞紧密连接蛋白 TXL klf5 AngⅡ

碳酸司维拉姆对慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化的作用

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碳酸司维拉姆对慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化的作用

作者：王春艳华北理工大学

学位级别：硕士

目的探讨碳酸司维拉姆对慢性肾衰竭大鼠高磷血症导致血管钙化的作用及机制。方法将40只25000g健康成年雄性SD大鼠进行数字标号,随机将其分为4组,每组10只,包括假手术组、模型组、碳酸钙组、碳酸司维拉姆组。假手术组仅行肾脏包膜切除... 详细信息

目的探讨碳酸司维拉姆对慢性肾衰竭大鼠高磷血症导致血管钙化的作用及机制。方法将40只25000g健康成年雄性SD大鼠进行数字标号,随机将其分为4组,每组10只,包括假手术组、模型组、碳酸钙组、碳酸司维拉姆组。假手术组仅行肾脏包膜切除,术后给予普食及净水喂养;余30只行5/6肾切除,造模采用两步法。术后均先给予普食及净水喂养,共计4周,抽取尾静脉血检测肌酐、尿素氮。然后肾切除组随机分为3组,具体方案如下:1)模型组(n=10):仅给予高磷饮食(磷1.2%,钙1.6%,维生素D1IU/kg)喂养10周。2)碳酸司维拉姆组(n=10):给予高磷饮食的同时给予碳酸司维拉姆(72mg/kg,3/日)喂养10周。3)碳酸钙组(n=10):给予高磷饮食的同时给予碳酸钙(150mg/kg,1/日)喂养10周。10周后,再次全麻大鼠,抽取下腔静脉全血,用生化分析仪测定大鼠血磷、血钙,酶联免疫吸附法测定C反应蛋白(C reaction protein,CRP)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)。抽血后留取大鼠胸主动脉全段,将其分为三段,上段用10%甲醛固定后石蜡包埋行Von Kossa染色评估钙化情况。中段在-80℃下封存行real-time PCR检测Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)及Krueppel样因子5(krueppel-like factor 5,klf5)m RNA的表达,免疫组化检测klf5、Runx2表达。下段液氮保存用于检测组织钙含量。留取肾脏组织用HE染色评估肾脏病变。结果 1假手术组及肾切除组大鼠肾功能变化:5/6肾切除组的尿素氮及肌酐水平均高于假手术组,组间比较差异有统计学意义(P5)。2各组大鼠钙磷水平比较:四组间血磷水平比较,差异有统计学意义(P5);两两比较显示,模型组、碳酸钙组及碳酸司维拉姆组血磷水平均高于假手术组,(P5),模型组血磷水平高于碳酸钙及碳酸司维拉姆组(P5),碳酸钙组血磷水平高于碳酸司维拉姆组(P5);四组间血钙水平比较,差异有统计学意义(P5),其中,假手术组最高,模型组最低,碳酸司维拉姆组低于碳酸钙组,组间比较差异均有统计学意义(P5)。3肾脏病理:光镜下:假手术组大鼠肾小球、肾小管及肾间质未见显著异常。模型组、碳酸钙及碳酸司维拉姆组肾小球均发生不同程度的硬化性改变,肾小管上皮细胞脱落、损伤,肾间质有炎细胞浸润伴纤维样改变。4主动脉钙盐沉积:Von Kossa染色结果显示模型组主动脉出现严重钙化;碳酸钙组主动脉钙化程度低于模型组;碳酸司维拉姆组大鼠仅有个别大鼠出现钙化;假手术组大鼠主动脉未见明显钙化。5钙含量:四组钙含量比较,差异有统计学意义(P5)。其中,模型组最高,假手术组最低,碳酸司维拉姆组的钙含量低于碳酸钙组,两两比较,差异均有统计学意义(P5)。6大鼠klf5及Runx2表达:模型组、碳酸钙组及碳酸司维拉姆组klf5及Runx2表达均高于假手术组(P5),碳酸司维拉姆及碳酸钙组大鼠主动脉Runx2、klf5的表达较模型组明显降低(P5),碳酸司维拉姆组表达水平低于碳酸钙组(P5)。7大鼠klf5及Runx2m RNA表达:四组Runx2 m RNA、klf5 m RNA表达水平比较,差异有统计学意义(P5)。其中,模型组最高,假手术组最低,碳酸司维拉姆组低于碳酸钙组,两两比较,差异均有统计学意义(P5)。8大鼠IL-6、CRP水平比较:四组间CRP、IL-6水平比较,差异有统计学意义(P5)。其中,假手术组最低,模型组最高,碳酸司维拉姆组CRP、IL-6水平低于碳酸钙组,两两组间比较,差异均有统计学意义(P5)。9碱性磷酸酶:四组间ALP比较,差异有统计学意义(P5),其中,模型组最高,假手术组最低,碳酸钙组高于碳酸司维拉姆组,两两比较组间差异均有统计学意义(P5)。结论 1碳酸司维拉姆可延缓慢性肾衰竭高磷血症所致的血管钙化。2碳酸司维拉姆延缓血管钙化的作用明显优于碳酸钙。3碳酸司维拉姆通过降低klf5和Runx2的表达来抑制血管钙化。图3幅;表11个;参107篇。

关键词：慢性肾衰竭高磷血症血管钙化 klf5 Runx2 碳酸司维拉姆

Krüppel-like factor 5在放射性肠损伤及其修复过程中作用的初步研究

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Krüppel-like factor 5在放射性肠损伤及其修复过程中作用的初步...

作者：顾源苏州大学

学位级别：硕士

目的探讨Krüppel-like factor5(klf5)在电离辐射所致放射性肠损伤及其修复过程中的作用。方法通过Cre-LoxP重组系统繁育Vil-Cre;klf5型C57BL/6小鼠，将它与klf5型小鼠随机分为未照射组(NC)、8Gy照射组、15Gy照射组，照射组小鼠给予200... 详细信息

目的探讨Krüppel-like factor5(klf5)在电离辐射所致放射性肠损伤及其修复过程中的作用。方法通过Cre-LoxP重组系统繁育Vil-Cre;klf5型C57BL/6小鼠，将它与klf5型小鼠随机分为未照射组(NC)、8Gy照射组、15Gy照射组，照射组小鼠给予200cGy/min的X射线全身照射。分别在照射后6小时、3.5天(或3天)、7天(或5天)处死小鼠，取空、回肠样本，通过H.E.染色、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹、TUNEL、Alcian Blue/PAS染色等方法，对klf5在放射性肠损伤中组织结构、细胞增殖、凋亡、分化的作用进行评价。结果(1)X射线可引起小鼠肠道系统损伤，表现为绒毛脱落、隐窝数减少、黏膜下层充血等，随着照射剂量的增加，肠道损伤程度加深，存活时间明显缩短。(2)klf5主要表达于肠隐窝的增殖细胞。(3)在生理状态下，klf5表达的下降，使回肠绒毛高度及隐窝深度、宽度显著低于对照组小鼠，而绒毛杯状细胞增加;同时，klf5的低表达没有影响潘氏细胞的分化以及凋亡的变化。(4)X射线可诱导klf5表达，促进隐窝内细胞增殖、向杯状细胞分化，其表达量减少使小鼠肠道修复功能减弱。(5)klf5表达的减少抑制了X射线引起的细胞凋亡。结论klf5在维持肠道组织结构稳定中具有重要作用，klf5表达减少，使肠道对X射线更为敏感。klf5能通过促进隐窝内细胞增殖、杯状细胞分化，对X射线引起的肠损伤进行修复。

关键词：离辐射肠损伤 klf5 Cre-LoxP

米非司酮衍生物FZU-00,033通过负调控klf5表达抑制三阴性乳腺癌的生长

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医学研究生学报 2018年第6期31卷 608-612页

作者：鲍敏陈海军毛新良陈策实刘蓉苏州大学药学院苏州215123 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室福州大学化学学院福州350108

目的米非司酮(MIF)在高浓度时可以抑制三阴性乳腺癌细胞的生长,文中旨在研究低浓度MIF的衍生物对三阴性乳腺癌细胞生长的影响。方法以三阴性乳腺癌细胞SUM149PT和HCC1937细胞为研究对象,将细胞分为DMSO组、MIF组(加10μmol/L MIF)、5μm... 详细信息

目的米非司酮(MIF)在高浓度时可以抑制三阴性乳腺癌细胞的生长,文中旨在研究低浓度MIF的衍生物对三阴性乳腺癌细胞生长的影响。方法以三阴性乳腺癌细胞SUM149PT和HCC1937细胞为研究对象,将细胞分为DMSO组、MIF组(加10μmol/L MIF)、5μmol/L FZU-00,033组、10μmol/L FZU-00,033组,处理24、48、72 h,用磺酰罗丹明B法检测细胞生长情况。取构建好的稳定过表达klf5的三阴性乳腺癌细胞HCC1937进行实验,细胞分为PCDH-DMSO组(空载PCDH,DMSO)、PCDH-FZU-00,033组(空载PCDH,10μmol/L的FZU-00,033)、klf5-DMSO组(过表达klf5,DMSO)以及klf5-FZU-00,033组(过表达klf5,10μmol/L的FZU-00,033)。Western blot方法检测药物处理后对细胞中klf5表达、PARP剪切的影响。另在原有PCDH-DMSO组、PCDH-FZU-00,033组、klf5-DMSO组以及klf5-FZU-00,033组基础上增设5μmol/L PCDH-FZU-00,033组(空载PCDH,5μmol/L FZU-00,033)和5μmol/L klf5-FZU-00,033组(过表达klf5,5μmol/L FZU-00,033),Western blot方法检测FZU-00,033对过表达klf5细胞的作用。结果与DMSO组比较,5μmol/L FZU-00,033组、10μmol/L FZU-00,033组、MIF组在24、48、72 h均明显抑制SUM149PT、HCC1937细胞的存活(P5μmol/L FZU-00,033组、10μmol/L FZU-00,033组、MIF组SUM149PT细胞存活率分别为[(100±4)%、(17±2)%、(5±1)%、(58±1)%],HCC1937细胞存活率分别为[(100±7)%、(39±1)%、(30±1)%、(62±1)%];与MIF组比较,5μmol/L FZU-00,033组、10μmol/L FZU-00,033组在24、48、72 h对SUM149PT、HCC1937细胞存活明显抑制(P5μmol/L FZU-00,033组、10μmol/L FZU-00,033组、MIF组均显著抑制klf5蛋白水平的表达且增加细胞凋亡;而与10μmol/L MIF组相比,5μmol/L FZU-00,033组以及10μmol/L FZU-00,033组显著增加细胞凋亡。与PCDH-DMSO组相比,10μmol/L PCDH-FZU-00,033组于48 h存活率降低[(100±6)%vs(39±2)%,P5],72 h存活率亦降低[(100±3)%vs(21±1)%,P5];与klf5-DMSO组相比,10μmol/L klf5-FZU-00,033组于48 h存活率降低[(100±1)%vs(47±1)%,P5],72 h存活率亦降低[(100±1)%vs(27±1)%,P5];同时,与10μmol/L PCDH-FZU-00,033组相比,10μmol/L klf5-FZU-00,033组于48以及72 h能增加三阴性乳腺癌细胞的存活且有统计学意义(P5)。与PCDH-DMSO组相比,5μmol/L PCDH-FZU-00,033组以及10μmol/L PCDH-FZU-00,033组的细胞凋亡显著增加;与klf5-DMSO组相比,5μmol/L klf5-FZU-00,033组以及10μmol/L klf5-FZU-00,033组的细胞凋亡亦显著增加。结论 MIF的衍生物能抑制三阴性乳腺癌细胞的生长,其作用机制与抑制klf5表达相关。

关键词：三阴性乳腺癌米非司酮衍生物 FZU-00,033 klf5 细胞生存

转录因子klf5在低氧条件下对人肺癌A549细胞糖代谢的影响及其机制

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转录因子KLF5在低氧条件下对人肺癌A549细胞糖代谢的影响及其机制

作者：李响南华大学

学位级别：硕士

目的:肿瘤细胞糖酵解关键酶通常表达升高,肺癌中的肿瘤代谢也异常活跃。klf5属于转录因子的一员,能参与多种肿瘤的发生发展,并具有环境依赖性。研究发现低氧能诱导klf5的表达,并促进肺癌细胞的增殖。但是低氧条件下诱导的klf5的表达是... 详细信息

目的:肿瘤细胞糖酵解关键酶通常表达升高,肺癌中的肿瘤代谢也异常活跃。klf5属于转录因子的一员,能参与多种肿瘤的发生发展,并具有环境依赖性。研究发现低氧能诱导klf5的表达,并促进肺癌细胞的增殖。但是低氧条件下诱导的klf5的表达是否会对代谢产生影响尚不清楚。本课题主要探讨了在低氧环境中A549细胞能量代谢的改变情况。通过观察葡萄糖的摄取,乳酸的分泌、ATP的生成以及糖酵解关键酶的变化情况探讨klf5与A549能量代谢中糖酵解关键酶之间的关系。本文旨在探讨肺癌A549细胞糖代谢的具体机制以及klf5在低氧环境中对A549细胞糖代谢的影响。以深入发现肺癌治疗的潜在靶点以及klf5在肺癌中的潜在作用机制。方法:A549细胞系由实验室留存,用含10%胎牛血清的1640培养基分别在21%氧气和1%低氧环境中培养A549细胞,ATP测试盒检测在不同处理条件下A549细胞内ATP浓度,乳酸测试盒检测不同浓度给药组和对照组A549细胞内乳酸浓度,葡萄糖测试盒检测细胞对培养液葡萄糖摄取量以及胞内葡萄糖浓度,Western blotting检测糖代谢相关蛋白LDHA、HK2、PKM2的表达。结果:1、1%低氧处理能促进A549细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的分泌。2、1%低氧处理能浓度依赖性的上调糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA的表达;处理24小时时关键酶的表达水平基本稳定。3、常氧条件下A549氧化磷酸化与糖酵解同时存在,1%低氧条件下A549主要以糖酵解为主要糖代谢方式。4、常氧条件下敲低klf5不影响A549细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的生成。5、1%低氧条件能诱导klf5的表达。6、1%低氧条件下敲低klf5能抑制葡萄糖的摄取、乳酸的分泌并能抑制ATP的生成。7、1%低氧条件下敲低klf5能抑制糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA的表达。8、1%低氧条件下过表达klf5能促进葡萄糖的摄取、乳酸的分泌并能促使ATP的生成。9、1%低氧条件过表达klf5能上调糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA的表达。结论:1、低氧能上调糖酵解关键酶的表达促进A549细胞的糖酵解并提高肿瘤细胞的存活率。2、klf5能影响A549细胞糖酵解的关键酶的表达并参与肿瘤细胞的能量代谢。

关键词：肺癌 klf5 低氧糖酵解

MIF-ANA通过抑制klf5表达抑制三阴性乳腺癌细胞生存

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MIF-ANA通过抑制KLF5表达抑制三阴性乳腺癌细胞生存

作者：赵平昆明医科大学

学位级别：硕士

目的：米非司酮(mifepristone MIF)为孕激素受体抑制剂,可作为非手术性抗早孕药。在前期相关研究中发现,该药也有抑制及杀伤三阴性乳腺癌细胞及干细胞的作用,但应用剂量较大,为减少其用量固做米非司酮类似物(mifepristone analogue, MIF... 详细信息

目的：米非司酮(mifepristone MIF)为孕激素受体抑制剂,可作为非手术性抗早孕药。在前期相关研究中发现,该药也有抑制及杀伤三阴性乳腺癌细胞及干细胞的作用,但应用剂量较大,为减少其用量固做米非司酮类似物(mifepristone analogue, MIF-ANA)进行试验。希望为三阴性乳腺癌治疗提供新的药物。方法：1.通过SRB细胞杀伤实验检测MIF-ANA对三阴性乳腺癌细胞(HCC1937、SUM149PT)的抑制及杀伤效果,同时对比MIF-ANA在低表达转录调控因子klf5三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中的药效。2.利用流式细胞术检测MIF-ANA对三阴性乳腺癌干细胞(HCC1937 CD44+/high/CD24-/low)的抑制及杀伤效果。3.运用Western Blot技术检测在三阴性乳腺癌细胞(HCC1937、 SUM149PT)中,MIF-ANA对锌指蛋白转录因子5(Kriippel-Like Factors5, klf5)表达的影响。结果：1.MIF-ANA对三阴性乳腺癌细胞(HCC1937、SUM149PT)有较明显的抑制和杀伤效果。而对不表达转录调控因子klf5的三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)抑制及杀伤效果明显较弱。2.MIF-ANA对三阴性乳腺癌干细胞(CD44+/high/CD24-/low)较MIF有更好的抑制效果。3.三阴性乳腺癌细胞(HCC1937、SUM149PT)中的转录调控因子klf5蛋白能被MIF-ANA抑制。结论：本研究证明了MIF-ANA对三阴性乳腺癌细胞及其乳腺癌干细胞有抑制和杀伤的效果,并且MIF-ANA的IC50比MIF明显减小。而MIF-ANA对三阴性乳腺癌细胞及肿瘤干细胞(cancer stem cells CSCs)的杀伤抑制机制可能与MIF相类似,既通过抑制转录调控因子klf5的表达,从而引起乳腺癌细胞及其干细胞的凋亡。

关键词：三阴性乳腺癌 MIF-ANA 肿瘤干细胞 klf5 米非司酮

Am80诱导klf5脱乙酰化和抑制血管平滑肌细胞增殖的机制研究

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Am80诱导KLF5脱乙酰化和抑制血管平滑肌细胞增殖的机制研究

作者：舒亚南河北医科大学

学位级别：硕士

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的增殖和分化受一系列调节因子构成的信号网络所调控。其中转录因子Krüppel样因子5(krüppel-like factor 5, klf5)通过调节增殖/分化基因的表达活性而影响细胞的增殖活性。有研究... 详细信息

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的增殖和分化受一系列调节因子构成的信号网络所调控。其中转录因子Krüppel样因子5(krüppel-like factor 5, klf5)通过调节增殖/分化基因的表达活性而影响细胞的增殖活性。有研究显示,人工合成的维甲酸衍生物Am80通过激活其受体RARα而抑制klf5与RARα相互作用和klf5的活化,进而解除klf5对p21基因表达的抑制。然而,Am80是通过何种机制抑制klf5活性尚不清楚。乙酰化修饰在klf5活性调节中具有重要意义,但对其在VSMC分化中的作用研究较少。本研究以组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylases, HDACs)为切入点,以p21为靶基因,探讨klf5乙酰化水平改变与其转录激活活性的关系,并揭示其作用机制。方法与结果:1 Am80抑制VSMC细胞周期的进程用流式细胞术检测细胞周期分布,结果显示,与对照组相比Am80刺激VSMC 24 h后,G0/G1期细胞所占比例上升了13 %,S期细胞比例下降了29 %。两组之间具有显著性差异。说明Am80可诱导细胞周期阻滞。2 Am80抑制VSMC增殖MTT分析结果显示,Am80刺激细胞12、24、48 h,VSMC增殖活性显著被抑制。与对照组相比,细胞增殖活性分别降低了44 %、35 %、26 %,该结果与细胞周期分析数据具有一致性。3 Am80诱导p21蛋白的表达为了探讨Am80诱导细胞阻滞的作用机制,我们选用不同浓度Am80刺激细胞24 h,提取总蛋白,观察细胞周期抑制蛋白p21表达的变化,Western blot结果显示,在Am80浓度为0-5μM范围内,随着Am80浓度增加,p21的表达水平呈剂量依赖性的升高,提示Am80可上调p21蛋白表达。4 Am80显著抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生与假手术组相比,球囊内皮剥脱后14天的模型组颈总动脉中膜内的VSMC排列紊乱,内膜呈弥散性增厚,管腔变小,内膜与中膜的厚度比值(I/M)(2.10±0.26)明显高于假手术组(0.18±0.08);Am80组新生内膜的增生程度和I/M比值(0.3±0.11)明显小于模型组(P 5,n=3)。结果表明,Am80可以明显抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生。5 Am80通过抑制klf5乙酰化上调p21表达为探讨Am80抑制p21表达的分子机制以及klf5乙酰化水平变化是否在该过程中发挥作用,进行观察了Am80对klf5乙酰化的影响。用不同浓度Am80(0、1、2、5和10μM)处理VSMC 2 h,提取细胞总蛋白,经抗klf5抗体免疫沉淀后,用抗赖氨酸抗体进行Western印迹分析,以检测klf5的乙酰化水平。结果显示,随着Am80浓度的增加,klf5乙酰化水平逐渐降低,具有明显的剂量依赖关系。整体动物实验也证明,与模型组相比,给予Am80的大鼠血管组织中,klf5乙酰化水平降低。在术后3 d和14 d时,Am80组血管乙酰化klf5水平分别较模型组下降了17 %和34 %。上述结果在整体水平及细胞水平证实,Am80能抑制klf5的乙酰化水平。6 Am80诱导klf5与HDAC2相互作用HDAC2是调节蛋白质乙酰化修饰的关键酶。为确定HDAC2是否参与Am80诱导的klf5脱乙酰化过程,本研究观察了klf5与HDAC2的相互作用。免疫共沉淀分析结果显示,在Am80刺激前后的VSMC中,klf5均可与HDAC2共沉淀;但是Am80刺激后,klf5和HDAC2相互作用程度呈剂量依赖性增强,说明Am80能显著促进二者结合。免疫双荧光共定位分析结果进一步证实,在VSMC中klf5与HDAC2共定位,叠加后的荧光强度随着Am80刺激而增强。给予RARα受体抑制剂Ro 41-5253预处理VSMC,可消除Am80诱导的klf5与HDAC2相互作用。上述结果表明Am80诱导klf5脱乙酰基与促进klf5与HDAC2的相互作用有关。7乙酰化的klf5促进p21启动子活性为了确定klf5是否参与调节p21启动子活性以及与HDAC2相互作用对其转录激活作用的影响,分别将p21启动子指导的报告基因质粒(p21-luc)与klf5和/或HDAC2表达质粒共转染293A细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析启动子的活性。结果显示,293A细胞共转染HDAC2和klf5后,所测得荧光素酶的活性比单独转染klf5升高了3倍。提示,klf5与HDAC2对p21基因启动子的激活具有协同效应。为了确定该协同效应是否与klf5的乙酰化有关,进而构建klf5乙酰化位点突变(K369R)的表达质粒,并分别将其与乙酰化

关键词： Am80 klf5 乙酰化 p21基因表达血管平滑肌细胞

转录因子Slug与klf5对肝癌肿瘤干细胞特性及耐药的影响

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转录因子Slug与KLF5对肝癌肿瘤干细胞特性及耐药的影响

作者：赵新宇上海交通大学

学位级别：硕士

肝癌在世界范围内是发病率第五和死亡率第三的癌症,而中国的肝癌发病人数占世界肝癌发病人数的一半。尽管各种治疗手段的使用极大地提高了肝癌病人的存活率,但是肿瘤干细胞引起的肿瘤的侵袭转移和对传统化疗药物的耐受依然是目前肝癌治... 详细信息

肝癌在世界范围内是发病率第五和死亡率第三的癌症,而中国的肝癌发病人数占世界肝癌发病人数的一半。尽管各种治疗手段的使用极大地提高了肝癌病人的存活率,但是肿瘤干细胞引起的肿瘤的侵袭转移和对传统化疗药物的耐受依然是目前肝癌治疗面临的难题。因此研究肝癌肿瘤干细胞的分子机制对肝癌的干预及治疗具有非常重要的意义。Slug根据以往报道是一类可以促进EMT发生的转录因子,其能够增加肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。并且经历EMT过程的细胞能够获得肿瘤干细胞的特征进而在转移至远处器官后成瘤。klf5蛋白被认为是在肿瘤细胞中促进肿瘤增殖的转录因子,并且在维持胚胎干细胞以及上皮干细胞特性中起着重要作用。然而,Slug和klf5在肿瘤细胞中,主要是肝癌细胞中对肿瘤干细胞及耐药的影响并不清楚。因此,本课题组使用分离侧群细胞(side population)的方法分离出肿瘤干细胞,并发现肿瘤干细胞中Slug的表达较低,klf5的表达变化不明显。为了进一步明确Slug与klf5在肿瘤干细胞特性中所起的作用,使用shRNA抑制Slug与klf5的表达并且对与干细胞相关的生物学功能包括耐药、迁移等进行检测,结果发现抑制Slug与klf5表达后细胞锚定非依赖性生长能力增强且细胞对多种化疗药物的耐受能力增加,提示了肿瘤干细胞特性增强。分析分子机制发现抑制Slug与klf5的表达可以增强多种肿瘤干细胞相关基因的表达,尤其是细胞膜表面蛋白泵ABC家族表达增加,并且使用ABC蛋白抑制剂可以缓解Slug与klf5表达降低所造成的对多种化疗药物的耐受、增加肿瘤细胞对药物的敏感性。同时,为了研究Slug与klf5在细胞EMT发生过程中所起的作用,首先对Slug与klf5敲除组细胞进行了迁移能力的检测,实验结果发现只有klf5在细胞迁移过程中发挥功能,而转录因子Slug对肝癌细胞的迁移没有影响。本课题组发掘了Slug和klf5新的生物学功能,并为肝癌致病的分子机制研究提供了新的线索。

关键词：耐药肿瘤干细胞 EMT klf5 Slug 肝癌